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猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）是单股正链的RNA病毒,属冠状病毒科德尔塔冠状病毒属,基因组大小为25.4kd,是目前已知的基因组最小的冠状病毒。该病毒是德尔塔冠状病毒属中目前唯一可以感染哺乳动物的冠状病毒。PDCoV对各年龄段的猪均易感,尤其是对新生仔猪具有较高的致病性,可引起严重腹泻和高死亡率。PDCoV还可能在野生动物如亚洲豹猫、中国雪貂和麻雀之间传播,也有研究表明人也可能是该病毒的潜在宿主。冠状病毒具有强大的逃逸先天免疫的功能,其编码的多种蛋白具有拮抗干扰素的产生与信号转导的作用,进而病毒能够逃避宿主的先天免疫屏障,在宿主体内繁殖传播。辅助蛋白是冠状病毒的种属特异性蛋白,也是冠状病毒的重要功能蛋白。研究表明不同种属的冠状病毒编码的辅助蛋白具有较强的拮抗宿主先天免疫的潜能。PDCoV共编码三种辅助蛋白分别是NS6、NS7、NS7a。鉴于此,（1）本研究制备抗NS7蛋白的单克隆抗体,该单克隆抗体还可以检测NS7a蛋白,同时还制备NS6蛋白的单克隆抗体,用于NS6、NS7和NS7a蛋白的血清学检测和蛋白功能研究,并且测定了对应单克隆抗体的抗原表位序列。（2）对PDCoV辅助蛋白对IFN-Ⅰ信号转导的作用展开了细致的研究。具体内容如下:1.PDCoV NS6、NS7蛋白单克隆抗体的制备与鉴定本研究使用原核表达的方式分别诱导表达NS6蛋白全长和NS7亲水区域蛋白,然后对目的蛋白进行纯化和浓缩,得到高浓度和高纯度的NS6融合蛋白和NS7亲水融合蛋白,免疫小鼠。运用间接免疫荧光的方法,筛选血清抗体浓度高的阳性小鼠的脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,再通过亚克隆筛选,得到能够稳定分泌抗目的蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株,接种小鼠腹部制备腹水单抗,成功制备抗NS6蛋白单克隆抗体NS6 5-A11和抗NS7、NS7a蛋白单克隆抗体NS7 1-A08。分别鉴定这两株单抗的抗原表位:NS6 5-A11为70EYGSIYGKDFI80;NS7 1-A08为111PSTLEED117。适用范围检测表明:NS6 5-A11单克隆抗体适用于IFA、Western Blot 等实验;NS7 1-A08 单克隆抗体适用于 IFA、Western Blot、IP等实验。另外,在使用NS7 1-A08单克隆抗体对本实验室分离的三株PDCoV毒株（GX2021-1、GX2022-1、GX2022-2）进行 Western Blot 检测时发现,不同毒株感染细胞后NS7a蛋白大小有明显的差别,然后通过实验证明造成G2022-1毒株编码的NS7a蛋白实际分子量大小偏大的关键氨基酸位点是位于NS7a蛋白第4位的Pro。推测可能是NS7a蛋白氨基酸发生突变后,引起NS7a发生蛋白翻译后修饰。2.PDCoV辅助蛋白拮抗干扰素信号转导功能的研究为了探究PDCoV NS6、NS7和NS7a蛋白对细胞I型干扰素信号转导的影响。首先,以pCAGGS-MCS为载体,构建NS6、NS7和NS7a的真核表达质粒,通过双荧光素酶报告基因实验,检测这三种辅助蛋白对IFN-β诱导的ISRE启动子活性的影响,发现NS6和NS7a对IFN-β诱导的ISRE启动子活性有明显的抑制作用,然而NS7无明显效果。运用实时荧光定量PCR同样证实NS6和NS7a能够明显抑制干扰素刺激基因ISG15、ISG56、OAS1的转录。随后,使用Western Blot检测NS6和NS7a对IFN信号通路中节点蛋白STAT1、STAT2、P-STAT1、和P-STAT2表达的影响,结果发现,NS7a对STAT1的磷酸化有明显抑制,并且呈现表达剂量依懒性,而NS6对这些节点蛋白的表达和磷酸化水平没有影响。其次,运用双荧光素酶报告系统分别检测NS6和NS7a对STAT1、STAT2、IRF9或STAT1+STAT2+IRF9（ISGF3）诱导的ISRE启动子活性的抑制效果,结果显示单独的STAT1、STAT2或IRF9无法诱导ISRE启动子活化。只有在三聚体ISGF3的诱导下,ISRE的启动子活性才能明显升高,并且NS6和NS7a可以有效抑制ISGF3诱导的ISRE启动子活性,进而拮抗Ⅰ型干扰素信号转导功能。此外,由于3株PDCoV GX2021-1、GX2022-1、GX2022-2毒株感染细胞后NS7a蛋白大小不同,因此对其拮抗I型干扰素信号通路的影响进行探究。通过检测发现,虽然不同毒株NS7a蛋白对IFN-β诱导的ISRE启动子活性的抑制作用无明显差别,但对干扰素刺激基因转录的抑制作用不同,蛋白分子量较大的NS7a蛋白（GX2022-1）对ISG15、ISG56、OAS1基因转录的抑制水平要弱于GX2021-1和GX2022-2毒株表达的NS7a蛋白。总之,本实验成功制备了 1株抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体命名为5-A11;1株抗NS7和NS7a的单克隆抗体命名为1-A08,并且分别准确测得了其抗原表位序列。本研究发现PDCoV GX2022-1毒株编码的NS7a蛋白第4位Pro的突变导致其蛋白分子量大小显著增加,并且突变后的蛋白其拮抗IFN-β介导的ISGs转录能力减弱。本实验初步探究发现NS6与NS7a可以拮抗ISGF3介导的ISRE启动子活性并且NS7a可抑制STAT1的磷酸化修饰。