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miRNA是一类内源性的,可以在DNA转录成RNA后调控基因表达的非编码小RNA,长度为20-25nt。自发现以来,许多科学家对它的基因序列、生物功能、作用机制等方面的进行了一系列的研究,结果显示它在真核生物的基因调控中起着非常重要的作用,广泛参与到细胞的生理过程中。越来越多的证据表明,miRNA在鸡组织器官的生物学功能调节中也发挥着重要的作用,但是在鸡发生应激性免疫抑制时的分子调控机制还知之甚少。为研究在皮质酮诱导下,雏鸡发生应激性免疫抑制后,它的主要免疫器官法氏囊、脾脏、胸腺发生的miRNA转录表达水平的差异,本试验采用在固始鸡的基础日粮中添加皮质酮,构建雏鸡应激性免疫抑制模型,然后通过高通量Solexa测序技术,鉴定雏鸡法氏囊、脾脏、胸腺中miRNA的表达谱,选择其中一些鉴定到的差异miRNA,结合在线免疫数据库以及生物信息学分析技术,预测分析差异表达的miRNA的靶基因,然后对这些预测到的靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析,最后得到在雏鸡发生应激性免疫抑制后,发生变化的一些基因所富集的通路。以期本试验的结果对揭示家禽应激性免疫抑制转录后分子调控机制提供依据,同时对新药物的靶标设计提供帮助。试验结果如下:1.在试验组、对照组的法氏囊s RNA文库中,分别鉴定到了13216125、12272198条原始序列,经筛选,得到的高质量读数分别占原始读数的94.40%、97.37%,miRNA所在的长度序列数目都占总序列数目80%以上;同样在脾脏s RNA文库中,分别鉴定到了14872759、12242442条原始序列,高质量读数分别占原始读数的91.67%、98.16%,试验组中miRNA所在的长度序列数目占总序列数目90%以上,对照组占80%以上;在脾脏s RNA文库中,分别鉴定到了13317382、13762779条原始序列,得到的高质量读数分别占原始读数的98.32%、、95.76%,miRNA所在的长度序列数目分别占总序列数目84.71%、87.45%。这些数据说明测序的结果符合miRNA鉴定与分析的需要。2.将miRNA所在的长度序列与基因库中的序列进行比对,测得成熟的miRNA 623种,鉴定到的miRNA的前体个数为518种。在试验组、对照组的法氏囊分别鉴定到了409、374种成熟miRNA,鉴定到的前体个数分别为345、307;同样,在脾脏分别鉴定到了375、402种成熟miRNA,前体个数分别323、340;在胸腺中分别鉴定到了439、483种成熟miRNA序列,前体个数分别为372、400。试验组与对照组测得的成熟miRNA、前体数目都相差不大,说明样本的相关性较强。3.通过MIreap软件进行预测分析,在六个文库中共得到新的miRNA 130种,且这些新miRNA多为mir-181、mir-146、mir-17、mir-10、let-7、mir-196家族的。在法氏囊组织中,试验组、对照组分别鉴定到76、55种新miRNA;同样,在脾脏组织中分别鉴定到64、61种新miRNA,在胸腺组织中分别鉴定到86、91种新miRNA。所测得的130种新的miRNA,可对其进行继续研究,判断其属性。miR-21-5p、miR-92-3p、let-7g-5p,都低丰度表达的是miR-6670-5p、miR-217-5p、miR-29a-3p等;在脾脏组织中,都高丰度表达的miRNA主要是miR-148a-3p、miR-30d、let-7g-5p、miR-7,都低丰度表达的是miR-133c-3p、miR-34a-5p、let-7a-3p等;在胸腺组织中,都高丰度表达的miRNA主要是miR-21-5p、let-7i、miR-146c-5p、miR-128-3p,都低丰度表达的是miR-1684a-3p、miR-458b-5p、miR-206等。高丰度表达的这些miRNA可能在机体发生应激性免疫抑制后的分子调控机制中起较大的作用,值得关注。4.在法氏囊试验组、对照组中,都高丰度表达的miRNA主要是let-7f-5p、miR-148a-3p、5.对试验组与对照组的法氏囊miRNA的测序结果进行分析,显著差异表达的miRNA为77个,其中上调34个,下调43个。同样,脾脏miRNA显著差异表达的miRNA的个数为71,其中上调23个,下调48个;胸腺miRNA显著差异表达的miRNA的个数为51,其中上调30个,上调21个。三组共同差异表达的为30个,其中有3个显著差异的miRNA在三组中都表现出上调表达,它们是gga-let-7g-5p、gga-miR-7b、gga-miR-103-3p;有2个都出现下调表达,它们是gga-miR-2954、gga-miR-181a-5p。6.对照鸡的参考序列,生物学预测分析了各器官差异表达的miRNA的靶基因,并对这些预测的靶基因进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。法氏囊差异表达的miRNA的靶基因有282个,GO term富集结果显示,富集显著的term有296条,主要涉及白细胞介素合成、细胞因子活性、细胞因子受体活性等;KEGG功能注释显示,这些预测的靶基因在心肌收缩﹑RNA聚合酶﹑肾素-血管紧张素系统、细胞因子受体互作等生物学通路中显著富集。脾脏差异表达miRNA的靶基因有241个,GO term富集结果显示,富集显著的term308条,主要涉及趋化因子介导的信号通路、炎症反应、基础转录因子等方面;KEGG功能注释显示,这些预测的靶基因在对应激的反应、细胞代谢过程、细胞凋亡、蛋白质转运等通路富集。胸腺差异表达miRNA的靶基因有164个,GO富集显著的有314条,主要涉及嗜中性粒细胞趋化性、细胞程序性死亡、细胞因子活性等;KEGG功能注释显示,这些预测的靶基因在p53信号通路、RNA转运、脂肪酸的降解、氨基酸生物合成等通路富集。验证了这些miRNA的功能和通路与应激性免疫抑制的相关性。