糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由遗传和环境因素共同导致的以慢性高血糖为主要特征的临床综合征。糖尿病可引起多种慢性并发症,导致肾、视网膜等多器官功能障碍或衰竭,严重者可致残或致死。有关糖尿病引起的神经系统并发症的研究多集中在周围神经系统,主要是糖尿病引起的周围神经病变。近年来的研究表明糖尿病同样引起中枢神经系统并发症,主要表现为糖尿病认知功能障碍(diabetic cognitive dysfunction)。海马是边缘系统的一部分,主要与学习和记忆功能有关。糖尿病认知功能障碍与高血糖导致的海马组织损伤密切相关。但是高血糖导致的海马神经元损伤的分子机制复杂,至今尚未完全明确。因此,探索高血糖导致的海马神经元损伤的具体机制对于预防糖尿病所致的认知功能障碍和提升糖尿病患者的生存质量具有重大的意义。钙离子(calcium ion, Ca2+)是细胞内常见的第二信使之一,它参与了诸如增殖、转录、胞吐、凋亡等细胞生理或病理过程。钙离子内流的主要通道包括电压调控钙离子通道、受体激活钙离子通道和钙池调控的钙离子通道。其中钙池调控的钙离子通道(store-operated calcium channels, SOCs)是包括神经元在内的多种细胞中钙离子内流的主要通道之一,它主要由基质相互作用分子(stromal interaction molecule, STIM)和钙释放激活的钙通道蛋白(calcium release-activated calcium channel protein, CRAR,也叫做Orai)组成。STIM是一个定位在内质网膜上的单次跨膜蛋白,它的主要作用为监测内质网腔中钙离子浓度。而Orai主要构成了细胞膜上的钙离子通道。钙池调控的钙离子内流(store operated calcium entry, SOCE)与钙平衡之间关系密切,当内质网中的钙离子浓度降低,STIM转位到细胞膜从而激活Orai等构成的钙离子通道,促进钙离子内流以提高内质网腔钙离子浓度,并为细胞浆补充钙离子。近年来的研究表明SOCE参与了帕金森病、阿尔茨海默病等多种神经退行性疾病的病理生理过程,其主要是通过调整SOCs开放频率和改变细胞内钙离子浓度来实现的。然而,SOCE是否参与了高血糖导致的海马神经元损伤及认知功能障碍,我们不得而知。因此,本实验旨在通过高糖刺激原代培养的神经元细胞,研究SOCE是否参与其中以及详细的作用机制。同时,本实验也通过链脲佐菌素(streptozocin, STZ)诱导斯普拉格道利(Sprague Dawley, SD)大鼠糖尿病模型,研究SOCE在糖尿病大鼠海马组织损伤中的作用,并且通过体内外阻断SOCE观察其在缓解海马神经元损伤中的效果,为深入研究高血糖导致的神经元损伤的分子机制和糖尿病认知功能障碍的发病机制提供新的实验室基础。第一部分：钙离子在高糖导致的神经元损伤中的作用目的：通过检测高糖刺激之后神经元的损伤情况以及细胞浆中游离钙离子浓度(cytoplasmic free Ca2+concentration, [Ca2+]cyt),在此基础上给予细胞内外钙离子螯合剂后,再次检测细胞浆中钙离子浓度以及神经元的损伤情况,探讨钙离子在高糖诱导的神经元损伤中的作用。方法：1.细胞培养：取18天孕龄的SD孕鼠,按照常规步骤取脑、剪碎、消化及计数后,将神经元接种于含Neurobasal+B27培养基且预先铺有多聚赖氨酸(Poly-D-lysine, PDL)的6孔板或96孔板中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每3天进行半量换液。2.细胞处理分组：原代培养的神经元常规培养后,分组并给予不同浓度的葡萄糖(0、25mM、50mM、75mM、100mM)刺激48h。各组分别为：正常对照组,高糖组,高糖+乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)组及高糖+BAPTA-AM (1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid,BAPTA-AM)组。3.检测神经元胞浆中钙离子浓度：将细胞中的钙离子使用Fluo-3/AM标记,使用流式细胞仪检测神经元胞浆中游离钙离子的浓度。4.神经元损伤情况的评估：采用MTT法检测各组中神经元的存活率,以对神经元的损伤情况进行评估及选择最佳葡萄糖刺激浓度。结果：1.高糖对神经元的损伤：0、25mM、50mM、75mM、100mM的葡萄糖浓度依赖性的降低神经元的存活率。其中50mM的葡萄糖刺激48h后神经元的存活率为54.29%±3.17%,所以选取50mM的葡萄糖作为下一步的刺激浓度。2.不同浓度葡萄糖对神经元胞浆中游离钙离子浓度的影响：0、25mM、50mM、 75mM、100mM的葡萄糖浓度依赖性的升高原代培养的神经元胞浆中游离钙离子的浓度。3.不同的钙离子螯合剂对神经元胞浆中游离钙离子浓度的影响：不管是细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM还是细胞外钙离子螯合剂EDTA,二者都可降低高糖升高的神经元胞浆中钙离子浓度,二者之间无统计学差别。4.钙离子螯合剂对于神经元损伤的影响：细胞内钙离子螫合剂BAPTA-AM和细胞外钙离子螯合剂EDTA都升高了由于高糖刺激而降低的细胞存活率,二者之间无显著的统计学差别。结论：1.葡萄糖可浓度依赖性的降低原代培养的神经元的存活率2.钙离子可能在高糖导致的神经元损伤中发挥作用。第二部分：SOCE在高糖诱导的神经元损伤中的作用机制的研究目的：检测高糖刺激后SOCE相关蛋白分子STIM1在基因及蛋白水平的表达,然后通过SOCs药物阻断剂和siRNA技术抑制SOCE,再检测胞浆中游离钙离子浓度及神经元存活率,并使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率及线粒体膜势能的变化,分别检测神经元胞浆及线粒体中细胞色素C (Cytochrome C, CytC)的变化,使用western blot技术观察不同凋亡蛋白的变化,以此探讨SOCE在高糖诱导的神经元损伤中的作用机制。方法：1.神经元转染及转染效率的检测：试剂公司设计并合成针对STIM1的小干扰RNA (small interference siRNA)序列。常规利用转染试剂脂质体2000将合成的特异性siRNA转染到原代培养的神经元中,4-6小时后换液,48小时后提取蛋白,通过qPCR及western blot验证转染的效率。2.细胞干预分组：磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)组、50mM葡萄糖刺激24小时组、48小时组、72小时组；PBS组、50mM葡萄糖组、葡萄糖+si-control组、葡萄糖+La3+组、葡萄糖+siRNA STIM1干扰组。3.检测STIM1的表达量：在以上刺激的终点,常规提取各组的总RNA及总蛋白,分别使用qPCR及western blot技术检测高糖诱导后STIM1的基因及蛋白的表达变化。4.检测各组胞浆中游离钙离子浓度的变化：在各组刺激结束后,使用流式细胞仪检测各刺激组中原代培养的神经元胞浆中钙离子浓度的变化。5.检测神经元的损伤情况：在各组刺激结束后,通过MTT法检测各刺激组神经元的存活率。6.检测各刺激组细胞凋亡率、线粒体膜势能(mitochondrial membrane potential, MMP):在各组刺激结束后,收集各组的细胞,给予Annexin-V/PI及罗丹明123 (Rhodamine123, Rh123),然后通过流式细胞仪观察各组细胞的凋亡率及线粒体膜势能的变化。7.检测各刺激组细胞胞浆及线粒体中的CytC的含量及凋亡蛋白的表达情况：分别收集神经元的胞浆及线粒体,检测胞浆及线粒体中CytC的含量,并通过western blot技术观察各凋亡蛋白的表达量。结果：1.针对STIM1的siRNA的鉴定：试剂公司设计合成针对STIM1的siRNA,通过qPCR及western blot检测发现siRNA可明显的抑制STIM1的基因及蛋白表达量。2.高糖对STIM1表达的影响：与对照组相比,50mM葡萄糖明显增加了STIM1的基因及蛋白的表达量,且影响至少持续达72小时。3.各刺激组神经元胞浆中游离钙离子浓度的变化：与对照组相比,La3+、siRNA STIM1均可明显降低高糖刺激而升高的钙离子浓度,且两组之间无显著的统计学上的差别。4.阻断SOCE及siRNA干扰后对神经元损伤的影响：与对照组相比,La3+、siRNA STIM1均可明显升高高糖降低的细胞存活率,且两组之间无显著的统计学上的差别。5.各刺激组细胞凋亡率及线粒体膜势能的变化：与对照组相比,50mM葡萄糖刺激后神经元凋亡率明显升高；线粒体膜势能大幅降低；与高糖刺激组相比,La3+、siRNA STIM1可降低神经元的凋亡率,提升线粒体膜势能。6.各刺激组CytC的变化：与对照组相比,高糖刺激组胞浆中CytC含量增加,而线粒体中CytC含量减少；与高糖刺激组相比,SOCE被阻断后胞浆中CytC含量相对减少,同时线粒体中CytC的含量相对增加,提示阻断SOCE可明显减少线粒体中的CytC释放入胞浆。7.各刺激组STIM1及各凋亡蛋白表达的变化：与对照组相比,高糖刺激组STIM1表达增加,凋亡蛋白Bax/Bcl-2比值增加,增加了caspase3的活化；与高糖刺激组相比,阻断SOCE可降低STIM1的表达,也降低了高糖刺激增加的Bax/Bcl-2比值,减少了caspase3的激活。结论：1.高糖可明显的增加SOCE相关蛋白STIM1的基因及蛋白表达。2. SOCE可能通过诱导凋亡促进神经元损伤。第三部分：SOCE在高血糖导致的糖尿病大鼠海马组织损伤中的作用机制的研究目的：通过免疫组化及western blot技术检测各组大鼠SOCE相关蛋白分子STIM1的表达情况,通过尼氏染色观察海马神经元的损伤情况,通过Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能,然后给予SOCE阻断剂科罗索酸后,观察以上指标的改变情况。同时检测大鼠海马组织线粒体中CytC的变化,通过western blot检测各凋亡蛋白的变化,进一步分析SOCE在高血糖导致的大鼠海马组织损伤中的作用机制。方法：1.体内实验的分组：将80只成年雄性SD大鼠随机分为正常对照组,糖尿病组,糖尿病+科罗索酸治疗1组(1mg/kg,溶于2ml生理盐水),糖尿病±科罗索酸治疗2组(2mg/kg,溶于2ml生理盐水)。糖尿病大鼠模型：60只大鼠腹腔注射STZ (50mg/kg,溶于10mM、pH4.5的柠檬酸盐溶液),48h后采集尾静脉血测空腹血糖,空腹血糖浓度大于250mg/dl即认为造模成功。正常组给予等量的生理盐水腹腔注射。科罗索酸1组：从第5周起,每天固定时间给予1mg/kg的科罗索酸灌胃,共治疗12周。科罗索酸2组：从第5周起,每天固定时间给予2mg/kg的科罗索酸灌胃,共治疗12周。对照组和糖尿病组给予等量生理盐水灌胃。治疗12周结束后,各组给予Morris水迷宫实验。大鼠在实验前后称重,留取血样,并将脑组织放入液氮或甲醛中备用。2.检测各组STIM1的表达情况：通过western blot和免疫组化检测各处理组STIM1蛋白的表达情况。3.检测各组脑组织的损伤情况：通过尼氏染色观察各处理组海马组织的病理变化。4.检测各处理组线粒体中的CytC的含量：分别收集各组海马组织的线粒体部分,检测线粒体中CytC的含量。5.检测各处理组凋亡蛋白的表达情况：分别提取各组海马组织的蛋白,通过western blot检测各凋亡蛋白的表达量。结果：1.糖尿病大鼠认知功能的变化：在Morris水迷宫实验中,与正常对照组相比,糖尿病大鼠潜逃时间延长,在目标象限停留时间百分比缩短；同时,各组游泳速度没有差异。2.糖尿病大鼠脑组织病理改变：尼氏染色发现糖尿病大鼠海马CA1区神经元锥体细胞排列疏松,部分神经元脱失,胞浆内尼氏小体数目减少；对照组大鼠CA1区神经元锥体细胞排列整齐,结构清楚,形态完整,尼氏体丰富。3.糖尿病大鼠脑组织STIM1及各凋亡蛋白表达的变化：与对照组大鼠相比,糖尿病大鼠脑组织中SOCE相关蛋白分子STIM1的表达明显增加,凋亡蛋白Bax/Bcl-2比值增加,caspase3活化增加,提示增加了神经元凋亡。4.药物干预对于大鼠认知功能及脑组织损伤的影响：与糖尿病大鼠组相比,药物干预能明显缩短大鼠潜逃时间,增加目标象限停留时间百分比。药物干预组大鼠海马CA1区神经元锥体细胞排列紧密,结构清晰,尼氏体数目增多。5.抑制SOCE对CytC的影响：与糖尿病组相比,药物干预组线粒体中CytC的含量相对增加,说明抑制SOCE能显著抑制线粒体中的CytC的释放。6.阻断SOCE对于STIM1及各凋亡蛋白表达的影响：与糖尿病组相比,抑制SOCE不仅抑制了STIM1的蛋白表达,也降低了高血糖刺激增加的Bax/Bcl-2的比值,减少了caspase3的激活,提示减少了神经元凋亡。结论：1. SOCE可能通过诱导海马组织神经元凋亡而导致海马组织损伤,从而导致糖尿病大鼠认知功能障碍。2.抑制SOCE后显著减轻了海马组织损伤,改善了糖尿病大鼠认知功能障碍。