目的:脊髓是疼痛信息传入和整合的初级中枢。传统观念认为,脊髓水平病理性疼痛的产生和维持完全是由神经元介导的,神经胶质细胞(星型胶质细胞和小胶质细胞)仅对神经元起支持和营养作用,而不具有细胞之间的突触性信息传递功能。然而,越来越多的证据表明脊髓后角胶质细胞激活与痛觉过敏的产生和疼痛持续状态有密切关系。研究表明,多种伤害性刺激,都可以激活脊髓水平的星型胶质细胞和小胶质细胞;激活的胶质细胞可释放多种细胞因子,如肿瘤坏死因子、白介素等促进痛和痛觉过敏的产生;而给予抑制胶质细胞功能或代谢的药物,如fluorocitrate、CNI-1493、米诺环素等则可对病理性痛和痛觉过敏产生明显的抑制作用,表明脊髓胶质细胞的活化在病理性痛和痛过敏的产生和维持中发挥重要作用。但此过程中,脊髓胶质细胞激活的机制尚不完全清楚。兴奋性氨基酸(excitatory amino acids, EAAs,包括谷氨酸及天门冬氨酸)是脊髓中传递伤害性信息的重要神经递质。已有资料表明,N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受体是中枢神经系统EAAs受体的一种亚型,属于离子型受体,广泛分布于中枢神经系统,参与众多复杂的生理反应和病理过程。大量研究表明,NMDA及其受体在脊髓伤害性信息的传递中起重要作用,外周伤害性刺激向中枢传递产生痛觉、诱导痛觉中枢敏感化需要有完善的NMDA受体系统。已有研究表明,NMDA受体参与神经病理性疼痛模型中脊髓后角胶质细胞的激活。但在外周炎性痛过程中,脊髓胶质细胞的激活是否也有NMDA受体的参与尚未见报道。蜜蜂毒(Bee Venom, BV)疼痛模型是一种新的疼痛模型,具有多种疼痛表型。大鼠足底皮下中心部位注入蜜蜂毒溶液不仅引起局部组织炎性红肿,还引起单相的持续1-2 h的自发痛反应和较长时间的注射部位原发性热和机械性痛觉过敏,更接近临床病理性痛,是研究炎性病理性痛的良好模型。我室既往应用免疫组化技术,初步观察了NMDA受体在该模型引起脊髓后角星形胶质细胞激活中的作用。本实验应用免疫印迹分析(western blot analysis)技术,观察蜜蜂毒炎性痛过程中脊髓后角星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilary acidic protein, GFAP)和小胶质细胞标记物CD11b/c(OX-42)蛋白表达的变化,以及NMDA受体阻断剂MK-801对其表达的影响,进一步研究NMDA受体在伤害性刺激引起的脊髓后角星形胶质细胞和小胶质细胞激活中的作用,为阐明胶质细胞在脊髓伤害性信息传递中的作用提供进一步的实验依据,为病理性疼痛的防治研究提供新思路和线索。1大鼠蜜蜂毒炎性痛可引起脊髓后角星型胶质细胞和小胶质细胞的激活方法:雄性Sprague-Dawley大鼠25只,体重200-220 g,随机分为sham组(n=5)和蜜蜂毒组(n=20)。蜜蜂毒组又进一步分为1 h组、1 d组、2 d组和4 d组4个亚组(每个亚组n=5)。Sham组大鼠右后足底皮下注射100μl NS,蜜蜂毒组大鼠则注射蜜蜂毒溶液100μl(4g·L-1)致外周炎性痛及痛过敏。注射蜜蜂毒后测定注射足60 min内的自发痛行为反应以及第1、2、3、4天的热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值。Sham组大鼠于足底注射NS后1 h,蜜蜂毒组则于足底注射蜜蜂毒后相应时间点取腰5(L5)脊髓后角,应用Western blot分析测定L5脊髓节段后角GFAP和CD11b/c(OX-42)表达的变化,分别用于反映脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活状态。数据用均数±标准差( x±s)表示。采用社会科学统计程序(Statistical Program for Social Sciences 13.0)进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),比较组间差异,有显著差异者用最小显著差法(least significant difference)进行两两比较,以p<0.05作为判断差异显著性的标准。结果:足底注射蜜蜂毒后,大鼠产生单相性的自发痛反应,表现为自发缩足、舔足甚至咬足行为,时间可持续至注射后60 min,与sham组相比,痛反应评分明显升高。大鼠足底注射蜜蜂毒后,注射部位热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值在在所观察的1 d-4 d的期间内均较sham组明显缩短(p<0.05),表明动物产生了热和机械痛觉过敏。痛觉过敏于足底注射蜜蜂毒后1 d最为明显,但随时间的延长逐渐减轻。Western Blot分析显示,与sham组相比,注射蜜蜂毒后1 h大鼠L4~L5脊髓节段后角GFAP和CD11b/c(OX-42)的表达未见增高(p>0.05)。然而在注射蜜蜂毒后1 d时可见GFAP和CD11b/c(OX-42)的表达较sham组明显升高(P<0.05),并可以持续到注射蜜蜂毒后4 d,但蜜蜂毒1 d组、2 d组和4 d组这三组之间未见明显差别(p>0.05)。上述结果表明在蜜蜂毒诱导的炎性痛和痛过敏中激活了脊髓星型胶质细胞和小胶质细胞。2 NMDA受体抑制剂MK-801抑制大鼠蜜蜂毒炎性痛所致脊髓后角星型胶质细胞和小胶质细胞的激活方法:雄性Sprague-Dawley大鼠25只,体重200-220 g,随机分为以下5组(n=5):①sham组:大鼠右后足底皮下注射生理盐水(normal saline, NS) 50μl。②蜜蜂毒组:大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液50μl(4g·L-1)致炎性痛和痛过敏。③NS+蜜蜂毒组:首先椎管内给予NS 10μl,15 min后于大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液50μl(4g·L-1)致炎性痛和痛过敏。④MK-801+蜜蜂毒组:首先椎管内给予MK-801溶液10μ(l10 nmol),15 min后于大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液50μl(4g·L-1)致炎性痛和痛过敏。⑤MK-801+sham组:首先椎管内给予MK-801溶液10μl,15 min后于大鼠右后足底皮下注射生理盐水50μl。各组动物均测定足底注射蜜蜂毒后60 min内的自发痛行为反应,并于1 d时测定热辐射缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值。测定结束后,取腰5(L5)脊髓后角,应用Western blot分析测定L5脊髓节段后角GFAP和CD11b/c(OX-42)蛋白表达的变化,分别用于反映脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活状态。第一部分实验结果显示,大鼠热和机械痛敏、以及GFAP和CD11b/c (OX-42)的表达均在足底注射蜜蜂毒后1 d时明显增多,所以本实验选取足底注射蜜蜂毒溶液后1 d的时间点,观察NMDA受体抑制剂MK-801对大鼠蜜蜂毒炎性痛所致脊髓后角星型胶质细胞和小胶质细胞的激活的影响。数据用均数±标准差(x±s)表示。采用社会科学统计程序(Statistical Program for Social Sciences 13.0)进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),比较组间差异,有显著差异者用最小显著差法(least significant difference)进行两两比较,以p<0.05作为判断差异显著性的标准。结果:1自发痛行为反应蜜蜂毒组大鼠产生了典型的单相性的自发痛反应,表现为自发缩足、舔足甚至咬足行为。NS+蜜蜂毒组动物的痛行为评分与单纯蜜蜂毒组无明显不同(P>0.05);MK-801+蜜蜂毒组大鼠的自发痛行为反应评分与蜜蜂毒组和NS+蜜蜂毒组相比明显下降(P<0.05)。MK-801+sham组和sham组的自发痛行为反应评分均为零。2热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值大鼠足底注射蜜蜂毒后,注射部位热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值较sham组明显缩短(P<0.05),表明动物出现了热和机械痛觉过敏。NS+蜜蜂毒组与蜜蜂毒组相比无显著性差异(P>0.05)。椎管内应用MK-801(MK-801+蜜蜂毒组)后,蜜蜂毒注射部位的热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值与蜜蜂毒组相比显著延长(P<0.05),而椎管内注射NS(NS+蜜蜂毒组)后,对蜜蜂毒引起的热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值的变化无明显影响,表现为NS+蜜蜂毒组热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值与蜜蜂毒组相比无明显差异(P>0.05)。椎管内注射MK-801(MK-801+sham组)对sham组大鼠热刺激缩足潜伏期和机械刺激缩足阈值无显著影响(P>0.05)。3 GFAP和CD11b/c(OX-42)的表达Western Blot分析显示,大鼠注射蜜蜂毒后,GFAP和CD11b/c(OX-42)的表达较sham组明显升高(P <0.05),椎管内应用MK-801(MK-801+蜜蜂毒组)后,GFAP和CD11b/c(OX-42)的表达与蜜蜂毒组相比明显下降,然而椎管内注射NS(NS+蜜蜂毒组)后,对蜜蜂毒组引起的GFAP和CD11b/c(OX-42)的表达无明显影响(P>0.05),表现为NS+蜜蜂毒组GFAP和CD11b/c(OX-42)的表达与蜜蜂毒组相比无明显差异(P>0.05)。椎管内注射MK-80(1MK-801+sham组)对sham组大鼠GFAP和CD11b/c(OX-42)的表达无明显差异(P>0.05)。结论:大鼠足底注射蜜蜂毒可引起注射部位炎性痛和痛觉过敏,并激活脊髓胶质细胞,NMDA受体非竞争性抑制剂MK-801可抑制大鼠蜜蜂毒炎性痛及痛过敏所致脊髓后角星型胶质细胞和小胶质细胞的激活,提示NMDA及其受体参与外周炎症性伤害性信息传入引起的脊髓后角星形胶质细胞和小胶质细胞的激活。