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本试验在研究猴头菌原生质体制备和再生的基础上,采用原生质体紫外诱变和60Co-γ射线辐照菌丝复合诱变的方法选育出一株猴头菌多糖高产菌株HE-UVB。通过采用正交试验确立猴头菌多糖的最佳提取方法,对猴头菌多糖依次通过DEAE-纤维素离子交换柱层析、SephadexG-200葡聚糖凝胶柱层析后,分离得到了纯化的猴头菌多糖HEPⅠ,并分别对粗多糖的理化性质、HEPⅠ的结构及体外抗氧化性质做了研究。
通过原生质体紫外诱变,筛选出遗传稳定性良好的诱变株HE-UV。在液体培养条件下,HE-UV比出发菌株的生物量提高9%,菌丝多糖产量提高28.88%。再以HE-UV为出发菌株,进行60Co-γ射线辐照诱变,选育出诱变株HE-UVB。该菌株遗传稳定性良好,生物量较出发菌株提高14.2%,菌丝多糖产量提高2倍多。
通过L16(43)及L9(34)正交试验,确立了猴头菌多糖的最佳提取方法为在微波低火处理3min后,采用热水提取法即在加水量为1∶20的条件下,100℃提取4hr,此条件下多糖提取率可达到18.86%。通过对猴头菌粗多糖的物理化学性质研究,表明猴头菌多糖为一种水溶性、呈黄白色粉末状的多糖,成份中不含有淀粉、单糖和二糖,其多糖含量为68.14%,蛋白质含量为17.5%。
脱蛋白后的粗多糖经通过DEAE-纤维素柱层析梯度洗脱,得到水洗脱多糖,再经SephadexG-200葡聚糖凝胶柱层析后,得到纯化的猴头菌多糖HEPⅠ,经醋酸纤维素薄膜电泳和凝胶柱层析鉴定其为纯多糖组分。
HEPⅠ的紫外光谱、红外光谱和其完全酸水解液的高效液相色谱分析表明,HEPⅠ不含核酸和蛋白质,可能含有乙酰基,组分中存在呋喃糖苷和硫酸基团,单糖是由D-葡萄糖、D-木糖、L-鼠李糖和D-半乳糖构成,其摩尔比为0.09∶1.646∶0.610∶0.098。
HEPⅠ的体外抗氧化试验表明,HEPⅠ有较强的清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的作用,在一定浓度范围内清除作用随着多糖浓度的增加而增强,但当多糖达到一定浓度后,作用效果不显著,甚至随其浓度的增加而下降。当对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率达到50%时,多糖浓度分别为1.45mg/mL和2.85mg/mL。同时研究还表明,猴头菌多糖HEPⅠ具有抑制红细胞膜脂质过氧化的作用,其相对氧化率在12%-82%。