论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),又称为猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起母猪的繁殖障碍和仔猪严重的呼吸系统疾病的高度接触性传染病。自2006年以后,我国在江西、河南、湖南等省发生了高致病性蓝耳病(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS),给我国养猪业带来了严重的经济损失,所以对PRRSV的遗传进化规律和致病机制的探究具有重要意义。黏膜免疫作为机体免疫系统重要的组成部分之一,主要是通过多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor,p Ig R)介导Ig A转运到黏膜表面发挥作用;在黏膜分泌物中存在的Ig G也发挥着重要的生物学作用。Ig G转运到黏膜表面主要是通过新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor,Fc Rn)介导,并在黏膜表面保护机体防止病原入侵的过程中起着重要作用。PRRSV可以通过子宫阴道黏膜或者呼吸道黏膜感染进一步进入机体,并对机体的免疫系统产生强烈的免疫抑制,所以Fc Rn在抗PRRSV感染中也可能起到重要的作用。目前有关Fc Rn的研究主要集中在人和小鼠方面,对猪Fc Rn及其在病毒感染机体中所发挥功能的研究很少。本研究以人和小鼠的Fc Rn功能以及本实验室在病原感染对猪Fc Rn表达调控方面的研究为基础,聚焦于PRRSV感染对宿主细胞Fc Rn表达的影响,以期为PRRSV免疫逃逸和持续性感染的分子机制研究提供线索。主要研究内容和结果如下:1.HP-PRRSV的分离鉴定与遗传进化分析本研究于2018年从新疆某猪场采集的病猪血液中分离了一株PRRSV,命名为XJ-China-2018。对临床样品采用RT-PCR扩增鉴定,在Marc-145细胞上进行病毒分离培养,采用间接免疫荧光对细胞培养物进行鉴定。通过噬斑纯化后,利用RT-PCR对分离株的全基因组进行扩增,应用Seq Man软件对测序结果进行拼接,并根据NCBI上已公布的PRRSV全基因组作为参考,将Nsp2和ORF5基因核苷酸序列进行遗传进化与同源性对比分析。结果表明临床病料经RT-PCR检测呈PRRSV核酸阳性,处理后的病料接种至Marc-145细胞72h之后产生CPE,间接免疫荧光鉴定为PRRSV抗原阳性。全基因组、Nsp2基因和ORF5基因核苷酸序列分析和同源性比对显示该分离毒株属于中国的高致病性PRRSV亚群。2.HP-PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞对Fc Rn表达的影响以及分子机制研究首先使用细胞自动计数仪和间接免疫荧光检测,排除了HP-PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)引起细胞死亡对Fc Rn检测过程造成的影响。Western-blot结果显示PRRSV感染PAMs能够显著下调Fc Rn的蛋白水平。同时发现PRRSV JXA1-R弱毒株与新疆分离株XJ-China-2018都能下调PAMs细胞Fc Rn的蛋白水平,且这种下调趋势呈剂量依赖性,可能与病毒的复制有关。为了探究PRRSV下调PAMs中Fc Rn表达的分子机制,使用蛋白酶抑制剂MG132和细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK分别作用PRRSV感染后的PAMs细胞,结果发现只有MG132能够显著抑制PRRSV感染细胞引起的Fc Rn下调作用。以上结果表明HP-PRRSV感染可能诱导Fc Rn通过蛋白酶体途径降解,从而导致PAMs中Fc Rn蛋白丰度下降。综上所述,本实验从临床病料成功分离了一株PRRSV,进一步研究表明PRRSV可能通过蛋白酶体途径下调Fc Rn的蛋白水平。本研究为PRRSV感染抑制黏膜免疫的分子机制提供了新的理论依据,为PRRSV免疫逃逸和持续性感染的研究提供了新线索。