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前列腺癌是男性高发的恶性肿瘤,在西方国家其死亡率位居于癌症死亡率第二位,在我国也呈逐年增加趋势。前列腺特异抗原PSA的发现提高了前列腺癌的确诊率,但是并没有降低死亡风险。早期前列腺癌是可以治愈的,但是复发和晚期转移的前列腺癌是不可治愈的,治疗手段上包括抗雄激素治疗,放射治疗、化学药物治疗等方法收到的治疗效果欠佳。近几年免疫治疗成为肿瘤治疗的新方法。本研究希望采用细胞免疫疗法提高前列腺癌的治疗效果。过继性嵌合抗原受体修饰的T细胞回输成功的治疗了难治性血液恶性肿瘤,这也暗示了这种方法在实体恶性肿瘤治疗应用的可能性。靶标抗原的选择极其重要,如前列腺癌表达很多特异性抗原,并且不在其他组织表达。这些组织限制性抗原可能成为CAR T细胞治疗前列腺癌的潜在靶标。以往的临床前研究中,已使用PSMA和PSCA作为CAR T细胞的靶标,但是治疗效果欠佳。所以本次研究全新设计了靶向PSCA的第三代CAR T细胞,采用了非病毒载体微环DNA作为转染的质粒,通过电转染的方法制造出全新的靶向PSCA的CAR T细胞,并对其生物功能和表达情况进行研究。获得靶向PSCA的CAR-T细胞后,检测其杀伤活性最直接的办法就是对靶细胞进行体外杀伤实验。第二部分实验设计了PSCA-CAR T细胞不同效靶比分别对靶细胞RT4和PC-3M细胞株进行体外杀伤实验,同时检测了细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量。体外的实验结果为体内实验提供了良好的基础,但是体外和体内环境因素的差异可能对PSCA-CAR T细胞发挥作用造成不同的影响,为此第三部分实验建立了人源化NOD/SCID小鼠模型,模拟人类肿瘤患者的体内环境,建造前列腺癌移植瘤小鼠模型后,给予PSCA-CAR T细胞治疗,观察肿瘤的体积情况,检测PSCA-CAR T细胞在体内的存活情况,以及体内IFN-γ和IL-2细胞因子分泌水平,评价体内抗肿瘤的疗效。第一部分第三代嵌合抗原受体PSCA scFv-CD28-CD137-CD3ζ的构建及CAR T细胞转染的实验研究目的:构建第三代嵌合抗原受体PSCA scFv-CD28-CD137-CD3ζ(PSCA-CAR)的结构,连接至微环DNA载体中,并对T细胞进行转染,检测CAR T细胞的生物功能。方法:通过全基因序列合成PSCA-CAR的结构并构建于pUC57载体中,通过基因工程技术将PSCA-CAR结构连接到亲本微环DNA载体中,提取含有目的片段的微环DNA并使用电转染的方法转染T细胞,获得PSCA-CAR T细胞。观察微环DNA转染T细胞的效果及转染效率,电转染对T细胞存活率的影响,微环DNA和电转染方法对T细胞表型的影响,流式细胞术检测PSCA-CAR在T细胞表面的表达情况,Western blot检测PSCA-CAR蛋白在T细胞的表达情况。结果:1成功的将PSCA-CAR结构通过基因工程技术连接到亲本微环DNA载体中,提取含有目的片段的微环DNA质粒,通过基因测序未发现目的片段有基因突变。2通过电转染的方法成功的将微环DNA转染了人T淋巴细胞,获得第三代PSCA-CAR T细胞,转染效率约58%,电转染后T细胞的存活率约60.2%。3电转染的方法对PSCA-CAR T细胞的增殖造成短暂的影响,经过后期细胞因子刺激培养后增殖活性恢复。4电转染的方法以及微环DNA载体对PSCA-CAR T细胞的表面分子表型没有影响。5流式细胞术检测了PSCA-CAR在T细胞表面的表达最高达88.96%。6 Western blot检测到T细胞中PSCA-CAR蛋白的表达。第二部分PSCA-CAR T细胞体外抗肿瘤的实验研究目的:研究PSCA-CAR T细胞体外抗肿瘤的作用。方法:PSCA-CAR T细胞分别与细胞表面不表达PSCA的PC-3M细胞株及天然高表达PSCA的RT4细胞株体外共培养,CCK8法检测CAR T细胞的体外选择性杀伤活性,ELISA法检测细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量。结果:1 PSCA-CAR T细胞对PSCA阳性表达的RT4细胞有较高杀伤效率,对不表达PSCA的PC-3M细胞的杀伤效率与普通T细胞相比无明显差别。2 PSCA阳性的RT4细胞可以明显刺激PSCA-CAR T细胞分泌大量IFN-γ和IL-2,而与不表达PSCA的PC-3M细胞共培养后IFN-γ和IL-2的分泌量极低,有明显统计学差异。第三部分PSCA-CAR T细胞体内抗肿瘤的实验研究目的:探讨PSCA-CAR T细胞对前列腺癌移植瘤小鼠模型的抗肿瘤作用。方法:采用鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法构建人源化的NOD/SCID小鼠模型,流式细胞术检测小鼠外周血中人CD3~+T淋巴细胞和CD19~+B淋巴细胞的表达情况,PCR法检测人源化小鼠骨髓细胞中人特异性ALU基因序列的表达情况。利用人源化的NOD/SCID小鼠制造前列腺癌移植瘤动物模型,成瘤后将动物随机分为三组进行试验,分别给予盐水、普通T细胞、PSCA-CAR T细胞治疗两次,观察肿瘤的生长体积。治疗4周后用流式细胞术检测PSCA-CAR T细胞在小鼠外周血的比例,ELISA法检测各组小鼠血清中IFN-γ和IL-2的分泌量。肿瘤标本进行病理切片,并免疫组化标记PSCA及人CD3的表达情况。结果:1人源化的NOD/SCID小鼠外周血中检测到人CD3~+T淋巴细胞和CD19~+B淋巴细胞的表达,表达比例在正常成人水平。PCR法检测到人特异性ALU基因序列在人源化小鼠骨髓细胞中表达。2 PSCA-CAR T细胞治疗组小鼠肿瘤体积明显缩小,与盐水组及T细胞组相比统计学分析有显著差异。3治疗4周后采用流式细胞术仍能检测到PSCA-CAR T细胞治疗组小鼠外周血中PSCA-CAR的表达,ELISA法检测血清中IFN-γ和IL-2的分泌量与其他组比较也明显升高,统计学分析有显著差异。4各组前列腺癌肿瘤标本免疫组化结果均高表达PSCA抗原,盐水治疗组的肿瘤组织无CD3表达,T细胞治疗组可见少量散在CD3表达,PSCA-CAR T细胞治疗组可见强烈的CD3表达。结论:1携带PSCA-CAR结构的微环DNA载体通过电转染的方法成功转染了人T淋巴细胞获得第三代PSCA-CAR T细胞,并且PSCA-CAR在T细胞上高水平表达。2 PSCA-CAR T细胞具有抗原依赖性激活的特征,体外在PSCA抗原的刺激下有强烈的抗肿瘤作用,并且分泌大量的IFN-γ及IL-2。3采用鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法成功构建了人源化的NOD/SCID小鼠模型,并在此基础上制造人前列腺癌移植瘤模型。PSCA-CAR T细胞可以在体内有效聚集到肿瘤组织发挥良好的抗肿瘤作用,使肿瘤体积明显缩小。