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[目的]
铜绿假单胞菌是临床最常见的条件致病菌之一,可感染人体各个组织和器官,对一些自身免疫缺陷的患者常可引起继发性机会感染,而多重耐药铜绿假单胞菌的出现给临床抗感染治疗带来极大的困扰。铜绿假单胞菌耐药机制非常复杂,常是多基因多因素共同作用的结果,为了解深圳地区铜绿假单胞菌的耐药现状及主要的耐药机制,掌握耐药基因的种类及其与耐药性的关系,分析耐药表型及耐药基因之间的相关性,并分析铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类的主要机理,为临床治疗铜绿假单胞菌感染的合理应用抗生素及流行病学研究提供依据和指导
[方法]
(1)收集深圳市第四人民医院2005年8月～2007年9月的铜绿假单胞菌临床分离株119例;对碳青霉烯类抗生素(亚胺培南和美洛培南)表现不敏感的铜绿假单胞菌29株;
(2)采用法国梅里埃细菌鉴定仪ATB PSE5试条测定这119株铜绿假单胞菌的药敏表型;
(3)采用E-test法检测29例对碳青霉烯类抗生素表现不敏感的铜绿假单胞菌对哌拉西林、头孢他啶、亚胺培南、美洛培南、庆大霉素、妥布霉素及环丙沙星7种抗生素的最小抑菌浓度;
(4)应用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取铜绿假单胞菌总DNA;
(5)以菌株DNA为模版,应用PCR技术分别扩增CTX-M、TEM、SHV、OXA、DHA-1、AmpC、GES-2、IMP-1、VIM-1、VIM-2、SPM、IntI、OprD、PER-1、VEB-1、CARB、KPC17个耐药基因;
(6)应用贝克曼CEQ8800测序仪对部分阳性的PCR产物进行DNA测序,并进行检索及基因分型;
(7)采用三维实验对AmpC及KPC酶进行表型测定;
(8)采用亚胺培南和美洛培南-EDTA双纸片增效法检测金属β-内酰胺酶表型;
(9)质粒接合实验检测金属β-内酰胺酶编码基因的转移。
[结果]
(1)119株铜绿假单胞菌在各临床标本中的分布分别为痰标本105例,占88.24％,呼吸道的分离率为88.24%,尿液标本6例,占5.04%,粪便标本2例,占1.68%,分泌物标本4例,占3.36%,其他2例,占1.68%。感染人群以40岁以上年龄段为主,占84.87%(101/119),科室分布以呼吸内科检出率最高,占24.37%,其次是脑(神经)外科(18.49%)和心血管内科(16.81%),ICU为13.45%,其他科室如普内、普外、综合检出占26.88%。
(2)铜绿假单胞菌对15种抗生素的药敏结果显示:对替卡西林、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林、妥布霉素、环丙沙星、头孢他啶耐药率均大于30%;耐药率最高为庆大霉素(53.78%)和头孢吡肟(44.54%);对亚胺培南和美洛培南耐药率为24.37%和23.53%;阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦的敏感率较高,为78.15%和72.27%;对多粘菌素E最敏感(96.64%),其中,有31例菌株表现为多重耐药,即对哌拉西林、环丙沙星/左氧氟沙星、亚胺培南和一种三代头孢菌素三种或以上药物耐药的菌株,占26.1%。
(3)铜绿假单胞菌17种耐药基因PCR扩增及测序结果显示:TEM阳性103株,占86.6%,SHV阳性2株,占1.7%,CARB-2(PSE-1)阳性菌株14例,占11.8%,OXA阳性菌株2例,占1.7%,DHA-1阳性菌株3例,占2.5%,AmpC阳性菌株77例,占64.7%,VIM-2阳性菌株19例,占16.O%,Ⅰ型整合子检出60例,占50.4%,OprD检出75例,占63.0%,外膜蛋白缺失率为37.0%,其余基因均阴性。本研究尚发现多耐药基因携带状况严重,经统计有78株铜绿假单胞菌同时携带有2个或以上的耐药基因,占65.5%。
(4)E-test法对29例耐碳青霉烯铜绿假单胞菌7种抗生素的最小抑菌浓度的检测,结果表明这29例铜绿假单胞菌均为多重耐药菌株,其中,这些菌株对亚胺培南、美洛培南及庆大霉素耐药率最高,均为89.7%,哌拉西林居第二位,耐药率为75.9%,以下依次是妥布霉素、环丙沙星及头孢他啶,耐药率分别为72.4%、69.0%和44.9%。
(5)三维实验及EDTA-亚胺培南和美洛培南双纸片增效实验结果:头孢西丁三维实验对AmpC酶表型进行确证,结果显示有5例出现矢状生长菌苔,这说明这5例铜绿假单胞菌是AmpC酶持续高产型菌株。利用亚胺培南和美洛培南双纸片扩散法对金属酶表型进行确证,结果表明有18例为金属酶确证实验阳性的菌株,其中有15例与VIM一2基因型检测一致,3例确证实验阳性但VIM-2基因型阴性,尚有1例VIM-2基因型阳性但确证实验阴性。KPC酶确证实验与KPC基因型检测一致,均阴性。
(6)1例携带有VIM-2型金属β-内酰胺酶编码基因的铜绿假单胞菌质粒接合实验阳性。
[结论]
(1)铜绿假单胞菌引起的感染以呼吸道多见,其致病性和耐药率有随年龄增长而增加的趋势。
(2)药敏实验结果显示深圳市第四人民医院铜绿假单胞菌耐药现状堪忧,多重耐药严重。
(3)铜绿假单胞菌多重耐药及碳青霉烯耐药机制均是多基因多因素共同作用的结果。
(4)深圳地区存在VIM-2型金属β-内酰胺酶,且具有一定的质粒传播性。
(5)产生金属β-内酰胺酶是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。
(6)CARB-2(PSE-1)型β-内酰胺酶对替卡西林和哌拉西林能产生很高的耐药性。
(7)EDTA-亚胺培南和美洛培南双纸片增效法是一种简便、经济、可靠的金属β-内酰胺酶筛选方法。
(8)合理选用抗生素、联合施治、提供细菌耐药快速有效的检出途径依然是防治铜绿假单胞菌感染及控制其耐药性传播的有效方法。