四氯苯醌(TCBQ)由氯酚类化合物五氯酚(PCP)代谢产生。作为持久性有机污染物(POPs)分子中的典型代表,PCP具有“三致”(致癌、致畸、致突变)毒性和环境激素效应,对人类健康危害极大。PCP在自然环境中化学性质稳定,但也能通过电化学反应、光催化反应及生物体内代谢等多种途径降解生成代谢物四氯氢醌(TCHQ)和TCBQ。PCP在体内代谢产生大量活性氧(ROS),破坏机体氧化还原平衡,引起一系列严重的人类疾病如炎症、神经退行性疾病、免疫缺陷、早衰和肿瘤等。DNA双链断裂(DSBs)被公认为是DNA损伤中最为严重的损伤形式,如果不能及时而准确地修复,可能会引起基因突变和染色体断裂,从而导致癌变。真核生物依靠DNA损伤反应(DDR)感受、传递损伤信号到各种效应蛋白,最终激活细胞周期阻滞、DNA损伤修复、程序性死亡(如凋亡、坏死)、衰老等通路来保护细胞。当外界或自身因素引起DSBs时,修复的主要机制有两种:非同源末端链接(NHEJ)和同源重组修复(HR)。HR途径是一种依靠同源DNA、精确度较高的修复途径。RAD51是HR通路中寻找同源序列和进行链交换的关键蛋白,是同源重组介导的DNA双链修复途径必不可少的重组蛋白酶。p53是DDR信号网络中的重要组成部分,对肿瘤形成起重要作用。当细胞DNA受损时,p53被激活,启动DNA修复通路,细胞存活;当细胞受损严重自身不能有效进行修复时,则激活细胞凋亡通路,促进细胞死亡,从而抑制正常细胞转化成癌变细胞。第一部分:本章实验首先用CCK-8法检测了TCBQ在不同浓度、不同时间下对MDA-MB-231细胞的毒性作用,结果表明TCBQ对细胞生长有明显的抑制作用。随后,利用彗星实验检测TCBQ处理后细胞DNA损伤情况,发现随着TCBQ暴露剂量和时间的增加,细胞彗星拖尾严重,olive尾矩逐渐增加,说明TCBQ能够导致细胞DNA双链断裂。采用Western blot和免疫荧光法检测DSBs标志物γ-H2AX和DSBs感应蛋白53BP1的表达情况,免疫荧光实验发现γ-H2AX和53BP1在细胞核内的聚集呈浓度、时间依赖性增多,Western blot法进一步证明TCBQ促进γ-H2AX和53BP1的表达,说明TCBQ能够诱导MAD-MB-231细胞持续性DNA损伤。同时,流式细胞术检测TCBQ刺激后MDA-MB-231细胞凋亡情况,发现细胞凋亡增加,且检测到细胞凋亡关键因子caspase-3的切割水平也明显上升。最后,分析TCBQ对同源重组修复通路关键蛋白RAD51的表达情况的影响。用Western blot法和RT-qPCR分别检测RAD51蛋白和mRNA表达水平,发现与对照组相比,随着TCBQ给药时间的增加,RAD51蛋白和mRNA水平都呈现出先增加后降低的趋势。TCBQ浓度较低时,RAD51表达的峰值出现时间延迟。免疫荧光实验检测RAD51焦点在细胞核内形成情况,RAD51焦点的形成结果与蛋白和mRNA水平类似,呈现先增加后降低的趋势。在本章TCBQ的毒理研究中,发现TCBQ具有遗传毒性,并且高浓度长时间作用时能够诱导MDA-MB-231细胞凋亡,产生DNA双链断裂,并影响DNA修复蛋白RAD51的表达。MDA-MB-231细胞在TCBQ作用下发生DNA损伤后,首先促进RAD51蛋白的表达并聚集在DNA损伤位点,启动了HR通路对相应的损伤进行修复,而细胞长时间暴露于高剂量的TCBQ下,DNA受到持续性的损伤,修复能力被抑制,细胞凋亡增加。第二部分:TCBQ的遗传毒性在第一部分中得到证实,但是TCBQ下调RAD51的机制还待分析。本部分实验首先通过泛素化实验表明,TCBQ作用于细胞6 h后对RAD51泛素化降解影响较小,说明TCBQ不影响RAD51在细胞质内的泛素化降解过程。通过加入蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)和mRNA合成抑制剂放线菌素(ActD)预处理细胞后,证明TCBQ几乎不影响RAD51蛋白的稳定性,但对mRNA的稳定性有较大的影响。针对上述检测结果,我们深入探究影响RAD51表达的上游信号通路。首先,采用Western blot法检测TCBQ作用于细胞后p53和p38 MAPK介导的损伤应激通路相关蛋白的表达,并加入其特异性阻断剂后,检测其对RAD51表达的影响。结果表明,TCBQ能够激活这两条通路,促进相关蛋白的表达,而p53通路主要参与TCBQ对RAD51的下调作用。免疫共沉淀实验结果表明,RAD51与p53蛋白之间存在相互作用,在TCBQ处理3 h后结合作用达到最大,而后随着RAD51蛋白的降低RAD51/p53结合减少。进一步验证p53对RAD51的调节作用,利用p53 siRNA干扰MAD-MB-231细胞p53蛋白的表达后,检测DNA损伤程度、细胞凋亡及RAD51的表达情况,发现降低p53的表达能反转TCBQ对RAD51的下调作用,减弱TCBQ对细胞凋亡和DNA损伤作用。以上实验结果说明,MDA-MB-231细胞在TCBQ作用后激活了p53信号通路,并参与调控RAD51的表达及细胞凋亡通路。证实了p53参与TCBQ对RAD51的下调,且激活细胞凋亡通路,具有介导细胞凋亡和调控DNA损伤修复的双重作用。第三部分:为研究RAD51基因对TCBQ引起细胞毒性作用的影响。我们构建了RAD51过表达质粒pEGFP-N1-RAD51和特异性干扰RAD51表达的siRNA,瞬时转染细胞后,采用彗星实验分析TCBQ导致的DNA双链损伤和CCK-8法检测细胞存活率,并用Western Blot法检测TCBQ诱导p53、DNA损伤蛋白γ-H2AX和凋亡蛋白cleaved-caspase-3的表达情况。结果表明,RAD51蛋白过表达后降低了TCBQ引起的细胞凋亡和DNA损伤,减少了TCBQ的毒性作用。而干扰了RAD51蛋白的表达后,TCBQ的毒性作用增强,细胞凋亡和DNA损伤程度更加严重,细胞存活率进一步受到抑制。同时,结果表明RAD51表达变化对上游调控蛋白p53的表达没有影响。根据以上结果可知,TCBQ可以通过影响RAD51的表达来抑制的同源重组修复,从而达到增强细胞毒性的作用。而p53对RAD51表达的调控对TCBQ引发细胞毒性有着重要意义。