抗阿特拉津功能基因trzN在水稻中的转化和抗性研究

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阿特拉津作为一种低毒、广谱、高效的除草剂,对一年、多年生植物具有较强的除杀能力,是除草剂中的重要品种,被广泛使用。但喷施除草剂阿特拉津,在杀死杂草的同时也将农作物非选择性的除杀,给农民造成不必要的损失。利用基因工程方法培育抗除草剂转基因作物可以方便、快捷的解决这一难题。本研究利用重叠延伸PCR方法,在不改变氨基酸序列的前提下,将阿特拉津脱氨水解酶基因trzN的两个碱基位点定点突变,以去除基因序列内部的两个酶切位点:BamHI酶切位点GGATCC改为GTATCC, KpnI酶切位点GGTACC改为AGTACC,同时在目的基因的5’端和3’端两端分别加上BamHI和KpnI酶切位点。改造好的目的基因与植物表达载体pVec-8Ubi连接,构建水稻过表达载体pVec-trzN。用农杆菌接介导法,将阿特拉津脱氯水解酶基因trzN导入到水稻粳稻品种日本晴(Oryza sativa L. cv. Nipponbare)中,经潮霉素抗性筛选得到54株再生幼苗。提取54株T0代转基因植株叶片的DNA,进行PCR验证。选取三株阳性植株提取总RNA,进行RT-PCR检测,所选取的3株转基因水稻均扩增出目的条带,表明trzN基因已成功转入水稻日本晴中。用水、1g/L助剂和0.0004g/L、0.004g/L.0.04g/L、0.4g/L、4g/L不同浓度阿特拉津处理日本晴水稻的萌发种子,结果显示:高于0.04g/L的阿特拉津可致使水稻叶片变黄甚至枯委,而0.0004g/L的阿特拉津幼苗与对照组无差异;用水、1g/L助剂、0.004g/L、0.04g/L、0.4g/L的阿特拉津处理转基因和野生型水稻的萌发种子,结果显示,转基因水稻的存活率高于野生型水稻,表现出阿特拉津抗性;用50mg/L阿特拉津涂抹转基因和野生型水稻的4叶期叶片,每株水稻涂抹两片叶子,两周后停止处理,四周后观察叶片表型,结果显示,转基因水稻植株高于野生型水稻,表现出阿特拉津抗性。
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