后发性白内障是白内障术后最常见的并发症,尽管手术技术的进步和人工晶状体材料及其设计的发展已经降低了后发性白内障的发生率,它仍是白内障术后视力下降的主要原因。目前认为后发性白内障的发病机制是手术残留的晶体上皮细胞异常的增殖、纤维化、移行并伴随细胞外基质的分泌。上皮细胞上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞获得间质细胞的特征,是后发性白内障发生的细胞学基础,通过该转化,晶状体上皮细胞间连接消失,细胞迁移能力增强。转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-p)是一种多功能蛋白质,属于转化生长因子-β超家族蛋白的成员,具有调节多种细胞的生长,分化、凋亡和免疫等多项功能。转化生长因子-β是晶状体在各种生理和病理状态下重要的调节因子,能够干扰正常的晶状体结构,并能够诱导晶状体上皮细胞发生异常的增殖、分化和凋亡,与囊膜下型白内障以及后发性白内障的形成有着密切的关系。转化生长因子-β包括三种TGF-β同源异构体,转化生长因子-β1,转化生长因子-β2和转化生长因子-β3,其中转化生长因子-β2在眼内房水及玻璃体内的含量及活性最高,是参与调节晶状体上皮细胞最强的细胞因子之一TGF-β2可以诱导晶状体上皮细胞发生上皮-间质转化,使晶状体上皮细胞丧失上皮细胞的极性,获得较强的迁移、侵袭和抗凋亡的能力等间质特性,从而具有类肌纤维母细胞样的特征。目前TGF-β2诱导晶状体上皮细胞上皮-间质转化细胞模型已成为白内障(包括前囊膜下和后囊膜混浊)形成的细胞模型而被广泛研究。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶家族,广泛的存在于哺乳动物的细胞浆中。mTOR信号通路与多种细胞的生长、增殖、分化、迁移、自我更新和细胞周期等密切相关,被认为是一个调节细胞周期进程和细胞生长增殖的信号汇聚点。mTOR可接受生长因子、营养(氨基酸)和能量等多种信号,通过包括PI3K/Akt信号通路在内的多条信号通路来发挥作用。目的研究PI3K/Akt信号通路在TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞上皮间质转化过程中的作用及其机制,以期为后发性白内障的发病机制提供确切的理论依据,为后发性白内障及此类疾病的药物干预提供新的靶点和新的思路及方法。方法1建立TGF-β2诱导HLECs (human lens epithelial cells)间叶样转化的体外培养体系常规培养HLECs-B3细胞系,待其长至80%融合时,去除培养液,PBS冲洗3次,加入不含FBS的DMEM培养基。加入TGF-β2.使其终浓度为10ng/ml,置于细胞培养箱中培养24小时。共聚焦细胞免疫荧光和western blotting法检测HLECs-B3细胞的上皮细胞标志蛋白——缝隙连接蛋白43(connexin43, Cx43)和间质细胞标志蛋白——纤维连接蛋白(fibronectin, FN)的表达变化。2检测PI3K/Akt信号通路主要信号分子在TGF-β2诱导HLECs发生EMT过程中的表达变化western blotting法检测PI3K/Akt信号通路主要信号分子,PI3K、Akt和mTOR的表达情况及其磷酸化水平变化。共聚焦细胞免疫荧光法检测各组细胞p-Akt在细胞内的定位。3CCK-8实验检测PI3K抑制剂LY294002对HLECs细胞增殖的影响在96孔板中培养HLEC-B3细胞,向培养板加入LY294002,使其终浓度分别为0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM和80gM,培养箱内培养24小时,向每孔加入10μL CCK-8溶液继续培养,分别于1h、2h、3h上酶标仪检测各孔吸光度(A)值,计算增殖抑制率。4观察PI3K抑制剂LY294002对TGF-β2诱导HLECs细胞上皮间质样转化的影响。4.1将细胞进行以下分组：对照组：常规培养的HLECs-B3细胞系,生长至80%融合后,换用无血清DMEM培养基后继续培养24h。TGF-β2组：常规培养的HLECs-B3细胞系,生长至80%融合后,换用无血清DMEM培养基,加入终浓度为10ng/ml TGF-β2继续培养24h。LY294002+TGF-β2组：常规培养的HLECs-B3细胞系,生长至80%融合后,换用无血清DMEM培养基,20μM LY294002预处理1h后,10ng/ml TGF-β2继续培养24h。4.2检测PI3K抑制剂LY294002在TGF-β2诱导HLECs发生EMT过程中对PI3K/Akt信号通路重要信号分子表达的影响western blotting法检测各组细胞PI3K、Akt、mTOR的表达情况及其磷酸化水平。共聚焦细胞免疫荧光法检测各组细胞p-Akt在细胞内的定位。4.3检测PI3K抑制剂LY294002对TGF-β2诱导HLECs发生EMT的影响。共聚焦细胞免疫荧光法和western blotting法检测各组细胞的上皮细胞标志蛋白Cx43和间叶样细胞标志蛋白FN的表达情况。5利用SPSS13.0软件进行统计学分析,所有实验数据以x±s表示,CCK-8实验在3个时间点检测的不同浓度LY294002对HLE-B3的A值的比较采用重复测量的方差分析。Western blot法检测各蛋白表达量三组间的比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用SNK法。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.TGF-β2诱导HLECs间叶样转化的体外培养体系的构建1.1共聚焦细胞免疫荧光检钡TGF-β2对HLECs上皮细胞标志物Cx43和间叶样细胞标志物FN表达的影响。为验证lOng/ml的TGF-β2确实诱导HLECs发生间叶样转化,我们用共聚焦细胞免疫荧光法检测上皮细胞标志物Cx43和间叶样细胞标志物FN的表达变化。结果发现,未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达丰富的Cx43以及微量的FN；而经TGF-β2处理24小时组,与对照组相比,Cx43表达下降,FN表达增高,其具体定量检测见Western blot检测。1.2Western blot检测TGF-β2对HLECs上皮细胞标志物Cx43和间叶样细胞标志物FN表达的影响。为了进一步验证10ng/ml的TGF-β2确实诱导HLECs发生间叶样转化,我们用Western blot法定量检测上皮细胞标志物Cx43和间叶样细胞标志物FN的表达变化,蛋白表达量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。结果发现,未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达丰富的Cx43(2.53±0.14),而经TGF-β2处理24小时组,与对照组相比,Cx43表达量(1.40±0.10)下降,两组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达微量的FN(0.29±0.02),而经TGF-β2处理24小时组,与对照组相比,FN表达量(0.97±0.09)明显增高,两组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。2.PI3K/Akt信号通路主要信号分子在TGF-β2诱导HLECs上皮-间叶样转化过程中的表达变化2.1共聚焦细胞免疫荧光检测TGF-β2对PI3K/Akt信号通路主要信号分子p-Akt3表达的影响。为验证TGF-β2确实通过PI3K/Akt信号通路诱导HLECs发生间叶样转化,我们采用共聚焦细胞免疫荧光法检测TGF-β2诱导HLECs发生间叶样转化过程中,PI3K/Akt信号通路主要信号分子p-Akt在细胞内定位及表达量的变化。结果发现,未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达微量的p-Akt,荧光显微镜下无明显细胞形态结构显现；而经TGF-β2处理24小时组,与对照组相比,p-Akt表达量明显增高,并向细胞膜聚集,使得细胞膜轮廓鲜明,在一部分细胞甚至能够清晰辨别细胞的形态,其具体的定量检测见Western blot检测。2.2Western blot检测TGF-β2对PI3K/Akt信号通路主要信号分子表达的影响。为了进一步验证TGF-β2确实通过PI3K/Akt信号通路诱导HLECs发生间叶样转化,我们用Western blot法定量检钡TGF-β2诱导HLECs发生间叶样转化过程中,PI3K/Akt信号通路主要信号分子的表达变化,蛋白表达量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。结果发现,未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达微量的p-PI3K(0.69±0.01),而经TGF-β2处理24小时组,与对照组相比,p-PI3K表达量(0.92±0.11)增高,两组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)；未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达微量的p-Akt (0.91±0.08),而经TGF-β2处理24小时组,与对照组相比,p-Akt表达量(1.48±0.13)增高,两组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)；未经TGF-β2处理的HLECs细胞(对照组)表达微量的p-mTOR (0.64±0.02),而经TGF-β2处理24小时组,与对照组相比,p-mTOR表达量(1.22±0.12)增高,两组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。3.CCK-8实验检测PI3K抑制剂LY294002对HLEC-B3细胞增殖的影响CCK-8实验检测不同浓度(0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM和80μtM)LY294002对HLE-B3细胞增殖的影响,于1小时、2小时、3小时上酶标仪读取各孔吸光度(A)值,统计分析结果显示：随着LY294002浓度的增加A值逐渐减小,即对HLE-B3细胞增殖抑制逐渐增强,A值在不同浓度组有显著差异(F=9.72,P=0.000)；不同时间点测得的A值也存在显著差异(F=1737.54,P=0.000)；浓度分组和测量时间点相互之间存在显著地交互作用(F=5.60,P=0.000)。4.PI3K抑制剂LY294002对TGF-β2诱导HLECs上皮-间叶样转化过程中PI3K/Akt信号通路信号分子表达变化的影响4.1共聚焦细胞免疫荧光检测PI3K抑制剂LY294002对TGF-β2诱导HLECs上皮-间叶样转化过程中PI3K/Akt信号通路信号分子p-Akt表达的影响。为验证在TGF-β2诱导HLECs发生间叶样转化过程中,Akt被磷酸化激活,我们用共聚焦细胞免疫荧光法检测在TGF-β2诱导HLECs发生间叶样转化过程中,PI3K/Akt信号通路主要信号分子p-Akt在细胞内定位及表达量的变化。结果发现,未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达微量的p-Akt,荧光显微镜下无明显细胞形态结构显现；而经TGF-β2处理24小时组,与对照组相比,p-Akt表达明显增高,并向细胞膜聚集,使得细胞膜轮廓鲜明,在一部分细胞甚至能够清晰辨别细胞的形态。而经LY294002预处理1小时后再加入TGF-β2继续处理24小时组,与TGF-β2组相比,p-Akt表达明显降低,荧光显微镜下亦未观察到明显的细胞形态结构。其具体的定量检测见Western blot检测。4.2Western blot检测PI3K抑制剂LY294002对TGF-β2诱导HLECs上皮-间叶样转化过程中PI3K/Akt信号通路主要信号分子表达的影响。为了检测PI3K抑制剂LY294002是否能够阻断TGF-β2诱导HLECs发生间叶样转化过程中PI3K/Aktf言号通路的激活,我们用Western blot法定量检测PI3K/Akt信号通路主要信号分子的表达变化,蛋白表达量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。结果发现,未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达微量的P-PI3K(0.69±0.01),而经TGF-β2处理24小时,与对照组相比,p-PDK表达量(0.92±0.11)增高,而经LY294002预处理1小时后再加入TGF-β2继续处理24小时组,与TGF-β2组相比,p-PI3K表达量(0.48±0.03)降低。三组间p-PI3K表达量差异具有统计学意义(F=35.50,P=0.000)；TGF-β2组与对照组两组间P-PI3K表达量差异具有统计学意义(P<0.05),TGF-β2组与LY294002+TGF-β2组两组间P-PI3K表达量差异具有统计学意义(P<0.05)。结果发现,未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达微量的p-Akt(0.91±0.08),而经TGF-β2处理24小时,与对照组相比,p-Akt表达量(1.48±0.13)增高,而经LY294002预处理1小时后再加入TGF-β2继续处理24小时组,与TGF-β2组相比,p-Akt表达量(0.95±0.19)降低。三组间p-Akt表达量差异具有统计学意义(F=15.04,P=0.005)；TGF-β2组与对照组两组间p-Akt表达量差异具有统计学意义(P<0.05),TGF-β2组与LY294002+TGF-β2组两组间p-Akt表达量差异具有统计学意义(P<0.05)。结果发现,未经TGF-β2处理的HLECs细胞(对照组)表达微量的p-mTOR(0.64±0.02),而经TGF-β2处理24小时后,与对照组相比,p-mTOR表达量(1.22±0.12)增高,而经LY294002预处理1小时后再加入TGF-β2继续处理24小时组,与TGF-β2组相比,p-mTOR表达量(0.76±0.07)降低。三组间p-mTOR表达量差异具有统计学意义(F=39.43,P=0.000)；TGF-β2组与对照组两组间p-mTOR表达量差异具有统计学意义(P<0.05),TGF-β2组与LY294002+TGF-β2组两组间p-mTOR表达量差异具有统计学意义(P<0.05)。5.PI3K抑制剂LY294002可阻断TGF-β2诱导HLECs细胞间叶样细胞转化5.1共聚焦细胞免疫荧光检测PI3K抑制剂LY294002对TGF-β2诱导HLECs上皮细胞标志物Cx43和间叶样细胞标志物FN表达的影响。为验证PI3K抑制剂LY294002确实阻断TGF-β2诱导HLECs发生间叶样转化,我们用共聚焦细胞免疫荧光法检测上皮细胞标志物Cx43和间叶样细胞标志物FN的表达变化。结果发现,未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达丰富的Cx43以及微量的FN；经TGF-β2处理24小时组,与对照组相比,Cx43表达下降,FN表达增高；而经LY294002预处理1小时后再加入TGF-β2继续处理24小时组,与TGF-β2组相比,Cx43表达增高,FN表达下降。其具体的定量检测见Western blot检测。5.2Western blot检测PI3K抑制剂LY294002对TGF-β2诱导HLECs上皮细胞标志物Cx43和间叶样细胞标志物FN表达的影响。为了进一步验证PI3K抑制剂LY294002确实阻断TGF-β2诱导HLECs细胞发生间叶样转化,我们用Western blot法定量检测上皮细胞标志蛋白Cx43和间叶样细胞标志蛋白FN的表达变化,蛋白表达量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。结果发现,未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达丰富的Cx43(2.53±0.14),而经TGF-β2处理24小时组,与对照组相比,Cx43表达量(1.40±0.10)下降,而经LY294002预处理1小时后再加入TGF-β2继续处理24小时组,与TGF-β2组相比,Cx43表达量(2.35±0.16)增加。三组间Cx43表达量差异具有统计学意义(F=60.02,P=0.000)；TGF-β2组与对照组两组间Cx43表达量差异具有统计学意义(P<0.05),TGF-β2组与LY294002+TGF-β2组两组间Cx43表达量差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明,未经TGF-β2处理的HLECs-B3细胞(对照组)表达微量的FN(0.29±0.02),而经TGF-β2处理24小时组,与对照组相比,FN表达量(0.97±0.09)增高,而经LY294002预处理1小时后再加入TGF-β2继续处理24小时组,与TGF-β2组相比,FN表达量(0.38±0.04)降低。三组间FN表达量差异具有统计学意义(F=117.01,P=0.000)；TGF-β2组与对照组两组间FN表达量差异具有统计学意义(P<0.05),TGF-β2组与LY294002+TGF-β2组两组间FN表达量差异具有统计学意义(P<0.05)。结论110ng/ml的TGF-β2能够有效诱导人晶状体上皮细胞发生上皮间质转化。2在10ng/ml的TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞发生上皮间质转化过程中,PI3K/Akt信号通路信号分子PI3K、Akt和mTOR被磷酸化激活。3随着LY294002浓度的增加,其对人晶状体上皮细胞的增殖抑制率逐渐增强。420μM的LY294002预处理人晶状体上皮细胞,能有效抑制TGF-β2诱导的PI3K、Akt和mTOR的磷酸化激活。520gM的LY294002预处理人晶状体上皮细胞,能有效抑制TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞上皮间质转化。以上实验结论共同论证了这一科学假说：TGF-β2通过PI3K/Akt信号通路诱导人晶状体上皮细胞上皮-间质转化。