【摘 要】
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[目 的]通过基因测序、免疫组化方法检测不同病理级别脑胶质瘤中RTEL1突变及表达情况,筛选过表达RTEL1的目的细胞,敲低其表达后检测肿瘤细胞增殖、细胞周期及端粒酶的活性,研究RTEL1在胶质瘤中的作用。[方 法]1.用TCGA中的基因表达谱数据动态分析数据库（Gene Expression Profilling Interactive Analysis,GEPIA）分析RTEL1对胶质瘤总体生
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[目 的]通过基因测序、免疫组化方法检测不同病理级别脑胶质瘤中RTEL1突变及表达情况,筛选过表达RTEL1的目的细胞,敲低其表达后检测肿瘤细胞增殖、细胞周期及端粒酶的活性,研究RTEL1在胶质瘤中的作用。[方 法]1.用TCGA中的基因表达谱数据动态分析数据库（Gene Expression Profilling Interactive Analysis,GEPIA）分析RTEL1对胶质瘤总体生存时间的影响;2.收集云南省肿瘤医院病理科低级别脑胶质瘤（Low-grade glioma,LGG）WHO Ⅱ 级、高级别脑胶质瘤（High-grade glioma,HGG）WHO Ⅲ-Ⅳ 级石蜡标本各20份,采用基因组提取试剂盒提取DNA,sanger测序测定端粒长度调节酶 1（Regulator of telomere length helicase 1,RTEL1）的两个常见单核苷酸多态性（Single nucleotide polymerphism,SNP）位点 rs6010620 和 rs4809324 突变情况,按照级别将胶质瘤分为低级别和高级别;按照35岁及以下、35-54岁、55岁及以上将胶质瘤组织分为A、B、C三组;按照性别分组分为男、女两组,分析突变频率在级别分组、年龄分组、不同性别之间是否存在差异。3.收集云南省肿瘤医院病理科低级别和高级别脑胶质瘤组织石蜡标本各20份,以及正常脑组织标本3例,进行免疫组化实验检测RTEL1在肿瘤组织及正常脑组织的蛋白水平的表达。4.Western blot检测A172、U87MG、U251三株胶质瘤细胞系中RTEL1蛋白的表达水平,筛选出过表达RTEL1蛋白的目的细胞株,对其进行培养传代,siRNA瞬时转染敲低细胞中的RTEL1,用qRT-PCR和Western blot验证敲低RTEL1的效果;分别应用CCK-8法、流式细胞术检测敲低RTEL1后对胶质瘤细胞增殖及细胞周期的影响;用端粒酶活性检测试剂盒检测敲低RTEL1后对细胞酶活性的影响。5.实验数据分析及作图采用统计软件包SPSS19.0和GraphPad Prism 6.0进行,实验所得数据采用均数±标准差（x±s）的方式表达,当多组间比较用单因素方差分析,组间两两比较时采用独立样本t检验;RTEL1的基因多态位点rs6010620和rs4809324突变在胶质瘤WHO分级、性别、年龄之间是否存在差异用卡方（Chi-Square,χ2）检验,以P<0.05为差异有统计学意义。[结 果]1.用GEPIA数据库分析RTEL1对LGG和HGG的生存时间影响发现过表达RTEL1的胶质瘤患者总体生存期缩短（P<0.05）;2.（1）RTEL1的SNP位点rs6010620突变率低级别胶质瘤较高级别高（P<0.05）;RTEL1的SNP位点rs6010620突变率与年龄分组之间差异无统计学意义（P=0.9802,P>0.05）;RTEL1的SNP位点rs6010620女性突变率高于男性（P<0.05）;（2）RTEL1的SNP位点rs4809324突变率高级别较低级别高（P<0.05）,35-54岁组的突变率均高于35岁及以下组、55岁及以上组（p<0.05）,不同性别分组之间比较差异无统计学意义（P=0.4256,P>0.05）;3.组织标本IHC结果提示胶质瘤组织RTEL1蛋白的表达水平比在正常脑组织高,且高级别低级别高（P<0.05）;4.Western blot检测提示RTEL1蛋白在U87MG胶质瘤细胞株中过表达,由此选为目的细胞株,siRNA瞬时转染敲低U87MG细胞系中RTEL1的表达,Western blot和qRT-qPCR实验验证了敲低效果;CCK-8法检测显示siRTEL1组细胞增殖显著低于空白组及对照组,提示敲低RTEL1后对肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用（P<0.05）;流式细胞仪检测结果表明siRTEL1组细胞周期大多停滞在G0/G1期,提示敲低细胞中RTEL1表达后抑制肿瘤细胞生长（P<0.05）;用端粒酶活性检测试剂盒检测当敲低RTEL1基因后胶质瘤细胞端粒酶活性受到抑制（P<0.05）。[结 论]低级别胶质瘤RTEL1的SNP位点rs6010620突变率较高,年龄分组之间差异无统计学意义,女性突变率高于男性;高级别胶质瘤RTEL1的SNP位点rs4809324突变率较高,35-54岁组突变率高于≤35岁组和≥55岁组,性别分组之间差异无统计学意义;胶质瘤组织中RTEL1蛋白水平的表达比在正常脑组织高,且高级别较低级别高;敲低胶质瘤细胞中RTEL1的表达后肿瘤细胞增殖抑制,细胞周期阻滞,对细胞的端粒酶活性也起到抑制作用。通过本研究为不同级别胶质瘤生物标记物的开发及转化研究奠定了实验基础。
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