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细胞移植、组织移植和器官移植作为挽救生命的重要手段,已经被人们熟知并接受。目前等待移植的患者持续增长,而供体来源的短缺严重限制了同种异体间的移植。人们不断寻找供体组织的替代品,异种器官和细胞提供了一个有吸引力的解决方法。由于猪的生理和解剖指标与人类相近,育程短,产仔多,仔猪生长迅速,易于在无特定病原体(specmc pathogen-free,SPF)条件下饲养,以及与灵长类相比伦理学障碍较小等原因,猪成为公认的异种移植的理想供体。将猪的器官移植到灵长类体内可能引起一系列免疫排斥反应,包括:超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR),急性血管性排斥反应(acute vascularreiection,AVR),细胞性排斥反应(acute cellular rejection,ACR)及慢性排斥反应。HAR和AVR主要是由受者体内的抗体识别猪器官表面的主要异种抗原半乳糖-α1,3-半乳糖(αGal)表位所引起,导致移植物迅速被排斥。除了人、猿和旧大陆猴,几乎所有哺乳动物细胞表面均表达αGal表位。αGal表位由α1,3-半乳糖转移酶(α1,3-galactosyltransferase,GGTA1 orα1,3GT)催化合成。人类不表达有功能的GGTA1,因此不产生αGal抗原。据报道,人体内约1%的循环IgG是抗αGal的天然抗体。去除猪细胞表面的αGal抗原是减轻免疫排斥反应的重要手段,常用策略包括:用α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,AGL)清除猪器官表面的αGal抗原;在猪的细胞内过表达α1,2-岩藻糖转移酶或α2,3-唾液酸转移酶使其与GGTA1竞争底物以及敲除GGTA1基因。前两者只能部分或暂时清除异种移植物表面的αGal抗原,残余的αGal分子仍可能激发补体的级联反应,导致移植物受排斥。而敲除猪GGTA1基因,则可完全去除供体器官表面的αGal表位。2003年PPL therapeutics公司和Pittsburgh大学的团队已经培育出GGTA1基因敲除(GT-KO)的纯合子猪,不表达主要异种抗原。我国在这一领域相对落后。本研究采用2种策略去除猪细胞表面的αGal抗原:1.使用基因重组α-半乳糖苷酶(r-AGL)去除猪红细胞(pRBCs)表面的αGal抗原,而后输注给猕猴,观察猕猴对pRBCs的免疫排斥反应速度,探讨猪到灵长类动物异种输血的可能性。2.对猪体细胞GGTA1基因进行修饰。构建了猪GGTA1基因的正负筛选打靶载体,并利用其在猪肾细胞系PK-15细胞中敲除GGTA1基因。第一部分:去除αGal抗原的猪红细胞输入猕猴体内的初步研究目的:探讨经重组α-半乳糖苷酶(r-AGL)去除了αGal抗原的猪红细胞(porcine red blood cells,pRBCs)输注给灵长类动物的可能性。方法:使用AGL处理pRBCs,应用流式细胞术检测酶解后pRBCs表面的αGal抗原水平;使用配血试验检测酶解红细胞与猕猴血清的相容性;用FITC标记pRBCs,将AGL处理的pRBCs与未处理的pRBCs分别输注给使用了免疫抑制剂(眼镜蛇毒因子及地塞米松)预注射的猕猴,流式细胞仪检测输注pRBCs在猕猴体内的存活时间,并计算其存活率,同时检测受试猕猴的血生化及尿液指标。结果:AGL有效清除了pRBCs表面的αGal抗原,使其与猕猴血清的凝集反应减弱。未酶解的pRBCs在猕猴体内存活＜0.5h:AGL酶解后的pRBCs输注后2h在猕猴体内有29%存活,8h在猕猴体内仍可检测到荧光标记的pRBCs。血、尿检测结果提示受体猴对酶解pRBCs的排斥反应减弱。结论:AGL能有效清除猪细胞表面的αGal抗原,减弱HAR,延长异种移植物的存活时间。第二部分:利用正负筛选打靶载体在猪肾细胞系PK-15细胞中敲除GGTA1基因。目的:构建猪GGTA1基因的正负筛选打靶载体,并在猪体细胞中敲除GGTA1基因。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出2个GGTA1基因的基因组片段。使用正负筛选打靶载体。以长约2kb包含部分9号外显子的片段为同源短臂,在XbaI和ClaI位点插入pLoxp质粒中neo序列的3’端。以长约5.4kb包括部分第8号外显子,全部第8号内含子以及部分第9号外显子的片段为同源长臂,于NotI位点插入该质粒中正筛选标记,neo序列的5’端;2.7kb的负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶(Tk)基因位于载体中同源短臂的3’端外侧。同源重组后,1.8kb的新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase,Neo)基因将插入9号外显子的5’端而使GGTA1基因失活。因为需从同源长臂5’端的SalI位点对载体线性化,打靶载体实际起作用的同源臂长度为7.1kb。将线性化的打靶载体通过脂质体lipofectamine 2000导入PK-15细胞,在含G418和GANC的选择培养基中培养,富集中靶克隆。挑取抗药性集落放大培养,提取基因组DNA,首先进行PCR筛选。在,neo基因的3’端设计上游引物Neol,在9号外显子的3’端同源短臂外侧设计下游引物P16,扩增出2.5kb片段的集落则可能是发生了同源重组的克隆。将PCR结果阳性的克隆进一步进行Southern杂交鉴定。在9号外显子同源短臂的外侧设计探针用于杂交。由此获得的细胞是杂合子细胞,含有一个正常的GGTA1基因和一个重组后的GGTA1基因。用BstEII内切酶消化基因组DNA后进行Southern杂交,中靶克隆应出现2条杂交带:内源性GGTA1基因出现7kb杂交带,插入neo基因的GGTA1基因出现8.8kb杂交带。而未发生同源重组的克隆仅有一条7kb杂交带。结果:成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体PSL/GT,并用于PK-15细胞GGTA1基因的敲除。在G418和GANC双重药物筛选条件下,共挑出436个抗性PK-15细胞集落,其中31个克隆PCR结果阳性。经Southern杂交鉴定证实其中1个克隆发生了同源重组,为杂合子。结论:本研究构建了有效的猪GGTA1基因的正负筛选打靶载体PSL/GT,并利用其在猪肾细胞系PK-15细胞中定向缺失GGTA1基因,获得了杂合子GGTA1(+/-)PK-15细胞。为进一步获得GT-KO猪用于异种移植的研究工作奠定了基础。