近年来,我国结直肠癌(colorectal cancer,CRC)新发病例逐年增加,已成为临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一。然而,由于结直肠癌早期检出率不高且易发生复发转移,许多患者被确诊时已是晚期,错过了最佳治疗时机,导致结直肠癌患者死亡率很高。因此,探索结直肠癌发生发展的分子机制,寻找可提供早期诊断的分子标记物,对于诊断和治疗该病具有重要的意义。研究证实,在肿瘤的发生发展过程中,有一系列基因的差异表达贯穿始终,FAM83D(Family with sequence similarity 83D,FAM83D)即是其中之一。FAM83D是FAM83家族成员之一,定位于人类20q染色体中;其主要功能是编码纺锤体相关的蛋白,与有丝分裂密切相关。另外,FAM83D在各种癌症如乳腺癌、肝癌以及肺癌中差异性表达,不仅是诊断和预后潜在的候选基因,而且参与调节癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移,因此,FAM83D可能成为肿瘤基因治疗的新靶标分子。然而,迄今为止,鲜见有关FAM83D在结直肠癌发生发展过程中的生物学功能及其分子机制的研究报道。为探索其作为新靶标分子的可能性,本课题首先采用qRT-PCR技术检测了 36对结直肠癌组织和正常结直肠组织中FAM83D mRNA的表达水平,然后应用qRT-PCR以及Western blotting技术检测了 7株结直肠癌细胞(Caco-2、RKO、DLD-1、HT-29、LoVo、SW480 和 HCT116)和一株正常结直肠上皮细胞(NCM460)中FAM83D mRNA及蛋白质的表达。结果表明,FAM83D在结直肠癌组织和细胞中均显著上调。接着,通过观察调控FAM83D表达对结直肠癌细胞SW480和HCT116的增殖、凋亡、侵袭及EMT的影响,初步探讨FAM83D在结直肠癌中发挥生物学功能的分子机制。第一部分FAM83D在结直肠癌组织和细胞中的表达情况方法1.收集标本,36例结直肠癌组织标本及癌旁正常结直肠组织标本。2.细胞培养,7株结直肠癌细胞(Caco-2、RKO、DLD-1、HT-29、LoVo、SW480和HCT116)和一株正常结直肠上皮细胞(NCM460)。3.采用qRT-PCR检测36例结直肠癌组织与对应的36例癌旁正常组织标本中FAM83D mRNA的表达情况。4.采用qRT-PCR和Western blotting方法检测结直肠癌细胞和正常结直肠上皮细胞中FAM83D mRNA和蛋白质的表达情况。5.统计学分析:所有实验数据采用均数±标准差方式表示,并使用SPSS 17.0软件对得到的数据进行统计分析。另外,单因素方差分析和t检验分析组间差异,其中,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果1.与正常结直肠组织比较,在结直肠癌组织中FAM83DmRNA表达显著上调。2.与正常结直肠上皮细胞(NCM460)比较,在结直肠癌细胞(Caco-2、RKO、DLD-1、HT-29、LoVo、SW480 和 HCT116)中 FAM83D 蛋白质和 mRNA表达显著上调,尤其是在SW480和HCT116细胞中(P<0.01)。第二部分FAM83D对结直肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响方法1.结直肠癌细胞 SW480 和 HCT116 经 FAM83D siRNA、negative control siRNA、pcDNA3.1-FAM83D 质粒以及空质粒 pcDNA3.1 negative control 转染构建FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞。qRT-PCR和Western blotting方法检测转染后FAM83D mRNA和蛋白质表达情况确定。2.实验分组:Control组:结直肠癌细胞(SW480和HCT116)正常培养,未做处理;pcFAM83D组:仅转染pcDNA3.1-FAM83D质粒;siFAM83D组:仅转染FAM83DsiRNA;过表达对照组(pcNC):仅转染pcDNA3.1-空载质粒;沉默对照组(siNC):转染 siRNAnegative control。3.MTT法检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的增殖。4.克隆形成实验检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的克隆形成能力。5.Cell Death Detection ELISA检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞凋亡。6.应用Transwell实验检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的侵袭能力。7.Western blotting和qRT-PCR检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中相关凋亡和EMT基因的蛋白质和mRNA表达。8.统计学分析:所有数据用均数±标准差表示,运用SPSS 17.0软件进行统计分析。并单因素方差分析和t检验分析,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果1.qRT-PCR 结果显示,与转染空质粒 pcDNA3.1 negative control(pcNC)比较,转染 pcDNA3.1-FAM83D 质粒后,SW480 和 HCT116 细胞 FAM83DmRNA表达水平分别上升至250%和280%,差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,与negative control siRNA 组比较,SW480 和 HCT1 1 6 细胞经 FAM83D siRNA 干扰后,FAM83D mRNA表达水平分别降低至30%和20%,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blotting 结果显示,SW480 和 HCT116 细胞经转染pcDNA3.1-FAM83D质粒后,FAM83D蛋白质表达水平显著升高(P<0.05)。此外,经FAM83DsiRNA干扰SW480和HCT116细胞后,FAM83D蛋白质表达水平显著降低(P<0.05)。2.MTT法检测结果表明,使用siRNA干扰技术敲除FAM83D可以抑制结直肠癌细胞增殖。此外,FAM83D过表达促进结直肠癌细胞增殖。3.克隆形成实验结果表明,使用siRNA干扰技术敲除FAM83D可以抑制结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的克隆形成。此外,FAM83D过表达促进SW480和HCT116中细胞的克隆形成。4.Cell Death Detection ELISA检测结果表明,FAM83D沉默使结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞凋亡显著升高。此外,FAM83D过表达使结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞凋亡显著降低。5.Transwell实验结果表明FAM83D沉默降低结直肠癌细胞侵袭的细胞数,而FAM83D过表达增加结直肠癌侵袭的细胞数。6.Western blotting和qRT-PCR检测结果表明,FAM83D沉默显著增加Bax、caspase-3以及caspase-9基因的蛋白质和mRNA表达,并显著降低Bcl-2和Bcl-xl的蛋白质和mRNA表达(P<0.05)。FAM83D过表达显著降低Bax、caspase-3以及caspase-9基因的蛋白质和mRNA表达,并显著升高Bcl-2和Bcl-xl的蛋白质和mRNA表达(P<0.05)。此外,FAM83D沉默促进E-cadherin的蛋白质和mRNA 表达(P<0.05),降低 β-catenin、N-cadherin、vimentin 和 Snail 的蛋白质及mRNA表达。FAM83D过表达显著降低E-cadherin的蛋白质和mRNA表达,促进 β-catenin、N-cadherin、vimentin 和 Snail 的蛋白质和 mRNA 表达(P<0.05)。结论在结直肠癌细胞SW480和HCT116中,FAM83D沉默抑制细胞增殖和克隆形成、促进细胞凋亡、降低细胞侵袭以及抑制EMT过程。此外,FAM83D过表达促进结直肠癌细胞增殖和克隆形成、抑制细胞凋亡、增加细胞侵袭以及诱导EMT过程。第三部分FAM83D调控结直肠癌细胞生物学功能的分子机制方法1.采用qRT-PCR检测36例结直肠癌组织与其对应的36例癌旁正常组织标本中FBXW7 mRNA的表达情况。qRT-PCR和Western bloting方法检测结直肠癌细胞和正常结直肠上皮细胞中FBXW7mRNA和蛋白质的表达情况。2.细胞转染及分组:pcFAM83D组:仅转染pcDNA3.1-FAM83D;过表达对照组(pcNC):仅转染空质粒pcDNA3.1;siFAM83D组:仅转染FAM83D siRNA;siFBXW7 组:仅转染 FBXW7siRNA;沉默对照组(siNC):转染 siRNA negative control;siFAM83D+ siFBXW7 组:转染 FAM83D siRNA 和 FBXW7 siRNA;siFAM83D+pcNotch-l 组:转染 FAM83DsiRNA 和 pcDNA3.1-Notch-l质粒。3.Western blotting和qRT-PCR检测FAM83D沉默和过表达后结直肠癌细胞SW480和HCT116中FBXW7、Notchl蛋白质和mRNA表达情况。此外,Western blotting和qRT-PCR检测FAM83D和FBXW7同时沉默之后Notchl蛋白质和mRNA表达情况。4.MTT法检测FAM83D沉默和Notch-1过表达对结直肠癌细胞SW480和HCT116增殖的影响。5.克隆形成实验检测Notch-1过表达后可否影响FAM83D沉默对结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的克隆形成能力。6.Cell Death Detection ELISA检测 Notch-1 过表达后可否影响 FAM83D 沉默对结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞凋亡率。7.应用Transwell实验检测Notch-1过表达后可否影响FAM83D沉默对结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的侵袭能力。8.Western blotting和qRT-PCR检测Notch-1过表达后可否影响FAM83D沉默对结直肠癌细胞SW480和HCT116中相关凋亡和EMT基因的蛋白质和mRNA表达。9.统计学分析:所有数据用均数±标准差表示,运用SPSS 17.0软件进行统计分析。并单因素方差分析和t检验分析,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果1.与正常结直肠上皮细胞比较,在结直肠癌组织中FBXW7 mRNA表达显著降低。与正常结直肠上皮细胞(NCM460)比较,在结直肠癌细胞(Caco-2、RKO、DLD-1、HT-29、LoVo、SW480 和 HCT116)中 FBXW7mRNA 和蛋白质表达显著降低,尤其是在SW480和HCT116细胞中(P<0.01)。与转染negative control siRNA 组比较,SW480 和 HCT116 细胞经 FAM83D siRNA 干扰后,FBXW7蛋白质和mRNA蛋白质表达均显著升高(P<0.05),但是Notch-1蛋白质和mRNA蛋白质表达均显著降低(P<0.05);与转染空质粒pcDNA3.1 negative control(pcNC)比较,转染pcDNA3.1-FAM83D质粒后,FBXW7蛋白质和mRNA蛋白质表达均显著降低(P<0.05),Notch-1蛋白质和mRNA蛋白质表达均显著升高(P<0.05)。此外,与 siFAM83D 组比较,siFAM83D+siFBXW7 组中 Notch-1蛋白质和mRNA表达均显著升高(P<0.05)。2.MTT法检测结果表明,SW480和HCT116细胞沉默FAM83D基因表达后,结直肠癌细胞的增殖能力显著降低(P<0.05)。此外,与siFAM83D组比较,siFAM83D+pcNotchl中细胞的增殖能力提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.克隆形成实验结果表明,使用siRNA干扰技术敲除FAM83D可以抑制结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的克隆形成。此外,与siFAM83D组比较,siFAM83D+pcNotchl中细胞的克隆数显著升高(P<0.05)。4.Cell Death Detection ELISA检测结果表明,FAM83D沉默使结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞凋亡显著升高。此外,与siFAM83D组比较,siFAM83D+pcNotchl中细胞凋亡显著降低(P<0.05)。5.Western blotting检测结果表明,FAM83D沉默显著增加Bax、caspase-3以及caspase-9基因的蛋白质表达,并显著降低Bcl-2和Bcl-xl的蛋白质表达(P<0.05)。此外,与 siFAM83D 组比较,siFAM83D+pcNotchl 中 Bax、caspase-3以及caspase-9基因的蛋白质表达降低,并Bcl-2和Bcl-xl的蛋白质表达显著升高(P<0.05)。6.Transwell实验结果表明FAM83D沉默减少结直肠癌细胞侵袭的细胞数。此外,与siFAM83D组比较,siFAM83D+pcNotchl中细胞侵袭的细胞数增加。7.Western blotting检测结果表明,FAM83D沉默促进E-cadherin的蛋白质表达(P<0.05),降低 β-catenin、N-cadherin、vimentin 和 Snail 的蛋白质表达。此外,与siFAM83D组比较,siFAM83D+pcNotchl中E-cadherin的蛋白质表达显著降低,β-catenin、N-cadherin、vimentin 和 Snail 的蛋白质表达显著上升(P<0.05)。结论1.FAM83D沉默促进结直肠癌细胞中FBXW7蛋白质和mRNA表达,FAM83D过表达抑制FBXW7蛋白质和mRNA表达。2.FAM83D沉默抑制结直肠癌细胞中Notch-1蛋白质和mRNA表达,FAM83D过表达促进Notch-1蛋白质和mRNA表达。3.FBXW7沉默逆转FAM83D对Notch-1蛋白质和mRNA表达的作用。4.FAM83D沉默通过调节FBXW7/Notch-l信号通路抑制结直肠癌细胞增殖及克隆形成、促进细胞凋亡、抑制侵袭以及EMT过程。