枯草芽胞杆菌R31是一株广谱抗真菌植物内生芽胞杆菌,在盆栽和大田试验中对香蕉枯萎病有一定的防治效果,但防治效果受到接种浓度和香蕉枯萎病初始发病率的影响而不稳定。Mn离子可以促进R31生物被膜形成和钝化香蕉枯萎病菌毒素主要成分镰刀菌酸对R31生物被膜形成的抑制,可以考虑用于R31的增效剂以稳定R31的防治效果并减少R31的使用量。本研究首先测定了不同浓度Mn离子促进R31在DSM₂培养基中的生长和生物被膜形成的效果,其次利用实时荧光定量PCR技术测定不同浓度Mn离子添加到DSM₂培养基中后对R31生物被膜形成和细胞分化调控相关基因表达的影响,并测定不同浓度Mn离子与R31联合灌根后对巴西蕉种苗不同时间点根系MnSOD活性和过氧化氢产生的影响,然后利用绿色荧光蛋白标记的R31测定不同浓度Mn离子对R31在香蕉根际定殖的影响,最后测定120μg/mL MnSO₄、9μg/mL镰刀菌酸（FA）与不同浓度R31处理对巴西蕉根系MnSOD和过氧化氢含量的影响。研究结果可以指导R31在不同情况下的香蕉枯萎病大田防治。结果如下:1.Mn离子促进R31在DSM₂培养基中生长和生物被膜形成:R31不能在DSM₂培养基上形成薄皮和具有扩展结构的菌落,但不同浓度的MnSO₄加入可以促进R31在液体培养基表面形成薄皮和固体培养基表面形成具有扩展结构的菌落,MnSO₄浓度120μg/mL时促进作用最明显。R31在DSM₂培养基中振荡培养时生长缓慢,迟滞期长达15 h,加入MnSO₄后可以促进R31的生长,并使迟滞期变为2h,但MnSO₄不同浓度之间促进生长效果差别不明显。2.Mn离子对涉及R31生物被膜形成、运动和胞外产物分泌相关基因表达的影响:包括md-PTR（涉及到编码胞外多糖（EPS）合成的依赖于Mn离子的酪蛋白磷酸酶编码基因）、md-IP（Mn离子依赖的无机焦磷酸合成酶编码基因）、epsG（胞外蛋白EPS合成相关基因）、aprE（碱性丝氨酸蛋白酶基因）、tasA（淀粉样蛋白合成基因）、flgG（鞭毛形成相关基因）、degU（细胞分化主调控因子）及sfp（表面活性素编码基因）在不同时间点表达量的变化。结果显示:不同浓度Mn离子添加均在R31生长早期（4-8 h）抑制md-PTR表达,中期（12 h）显著促进md-PTR表达,其中80μg/mL MnS04在各个时间点都促进该基因的表达;不同浓度Mn离子添加总体上促进R31 epsG基因表达,不同浓度促进规律存在差异,但不同处理的epsG表达峰值均出现在12 h;Mn离子添加在R31生长早期抑制sfp基因表达,生长中期促进sfp基因表达,基因表达峰值出现在12 h;Mn离子添加促进R31 aprE基因表达,促进作用从8 h一直持续到48h,不同浓度的Mn离子都表现出促进作用;不同浓度Mn离子添加在早期或抑制degU表达或对其影响不明显,只在48h时才明显促进deg基因表达;不同浓度Mn离子添加均抑制flgG表达;不同浓度Mn离子添加对tasA基因和md-IP基因表达无影响。综上所述,Mn离子能够促进R31胞外蛋白酶编码基因aprE在生长早期表达,促进生物被膜形成相关基因md-PTR、epsG、sfp在生长中期显著表达,促进运动和胞外分泌调控基因degU晚期表达,抑制运动相关基因flgG表达。3.Mn离子对R31定殖引起的香蕉根系过氧化氢和MnSOD活性的影响:结果表明:10⁶ cfu/mL和10⁷ cfu/mL R31单独接种处理引起香蕉根系MnSOD活性在接种4h达到最高水平,并引起根系过氧化氢含量显著增加。10⁸cfu/mL R31接种的根系MnSOD在所有检测时间点均维持在4 U/g的活力水平,并未出现大幅度波动。总体而言,MnSO₄对稳定10⁶ cfu/mL R31接种引起的根系MnSOD和过氧化氢变化效果较弱;低浓度MnSO₄有利于稳定10⁷ cfu/mLR31接种引起的根系MnSOD和过氧化氢变化变化,以80 μg/mL MnSO₄效果最佳。10⁸cfu/mLR31单独接种或80μg/mL MnSO₄与10⁷ cfu/mL R31联合接种最有利于植物维持稳定的根系MnSOD活性和过氧化氢含量。4.Mn离子促进R31在巴西蕉根表定殖:10⁸cfu/mL R31-gfp处理的巴西蕉根表和根毛荧光亮度明显高于10⁷cfu/mL R31-gfp处理,但10⁶cfu/mL R31-gfp处理根系未见明显的荧光。40μg/mL MnSO₄可以增加10⁷ cfu/mL R31-gfp处理根系荧光亮度,MnSO₄浓度升高到80μg/mL,荧光亮度更强,随着MnSO₄浓度再升高,荧光亮度反而更暗。80μg/mL MnSO₄与10⁷ cfu/mL R31结合最有利于R31在巴西蕉根系定殖。5.Mn离子钝化毒素同时对R31定殖引起的香蕉根系过氧化氢和MnSOD活性的影响:FA单独处理引起巴西蕉根系MnSOD活性在4h微弱上升,但引起过氧化氢在8 h显著增加;FA对10⁶cfu/mL和10⁷cfu/mL R31处理巴西蕉根系MnSOD和过氧化氢的变化影响不明显,但显著提高10⁸cfu/mLR31接种处理的根系MnSOD和过氧化氢含量;120μg/mL MnSO₄添加有利于稳定FA+10⁷cfu/mL R31处理的根系MnSOD和过氧化氢含量,引起FA+10⁸ cfu/mL R31处理根系MnSOD维持高水平并使过氧化氢含量增加。Mn离子通过未知途径刺激R31胞外物质分泌相关的基因表达并促进R31生长和生物被膜形成;80μg/mL MnSO₄有利于稳定10⁷cfu/mL R31处理巴西蕉根系MnSOD和过氧化氢波动,与10⁸ cfu/mL R31处理巴西蕉根系MnSOD和过氧化氢变化类似,并显著促进10⁷cfu/mL R31-gfp在巴西蕉根表形成荧光膜;9 μg/mL激发巴西蕉根系过氧化氢接种后8 h爆发,120 μg/mL MnSO₄与10⁷cfu/mL R31联合处理有利于稳定FA存在时的巴西蕉根系免疫反应。基于Mn离子的上述研究,可以考虑将Mn离子用于枯草芽胞杆菌R31防治香蕉枯萎病的增效剂。