第一部分:胃癌是否产生炎症因子CRP以及CRP对OPCs的增殖及成骨分化影响研究肿瘤的进展不仅与肿瘤细胞的内在特性有关,而且与人体的炎症反应密不可分。通常,C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）被认为是反应组织感染和损伤的的重要因素,其浓度是系统性炎症的可靠标志。其快速升高与肿瘤坏死因子α（TNF-α）,白介素6（IL-6）和其他促炎细胞因子有关,这些促炎细胞因子使得许多癌症包括胃癌的进程加速。众所周知,骨转移是癌症后期严重的并发症,据报道CRP水平与骨矿物质密度,长骨骨折和椎骨骨折之间也存在密切相关性。因此,本文将对胃癌与CRP之间的关系以及CRP对原代培养SD大鼠乳鼠颅骨成骨细胞前体细胞（osteoblast precursor cells,OPCs）增殖及成骨分化的影响展开研究。我们分析25名非骨转移性胃癌患者的血清钙（C a2+）,磷（Pi）,碱性磷酸酶（ALP）,超敏C-反应蛋白（hs-CRP）和降钙素原（PCT）浓度和骨CT片,发现在以上患者中,血清Ca2+、Pi浓度比正常人急剧下降（p<0.01）,ALP的浓度随着正常值上下波动（p<0.05）,hs-CRP（p<0.001）和PCT（p<0.05）浓度比正常人升高。3张胃癌患者椎骨CT片与正常人比较可见明显圆形低密度阴影。人胃癌细胞系HGC-27细胞（1×107cells/m L）注射BALB/c裸鼠。90天后,检测上述两组裸鼠血清中Ca2+,Pi,ALP和CRP浓度。处死裸鼠采集股骨,通过H&E染色、显微计算机断层扫描（Micro-CT）、免疫组化、免疫荧光等技术检测骨组织受损程度。体内实验结果显示,与注射PBS的BALB/c裸鼠相比,注射HGC-27细胞后的BALB/c裸鼠Pi、Ca2+和ALP血清浓度显著下降（p<0.05）,CRP浓度随时间而上升（p<0.01）。股骨H&E染色显示无胃癌骨转移,但股骨有明显的空泡和骨丢失。Micro-CT结果显示,注射HGC-27细胞组比正常组骨松质和骨密质均有明显的降低,骨耐受力也明显降低（p<0.05）;免疫组化显示OPN阳性区域较对照组明显减少（p<0.001）。此外,将OP Cs细胞随机分为对照组和重组CRP处理组,通过CCK8、Ki67免疫荧光检测各组细胞的增殖活性。体外实验结果显示,与对照组相比,重组CRP处理组OPCs细胞增殖活性明显降低（p<0.001）。通过cyclin D1和cyclin D1免疫荧光、蛋白质免疫印迹实验和细胞流式技术检测重组CRP对OPCs细胞周期的影响。结果表明,重组CRP通过阻断O PCs的G1/S过渡期来抑制细胞增殖。通过茜素红染色、Western-blot、免疫荧光和ALP活性检测重组CRP对OPCs成骨分化的影响。结果表明,重组CRP抑制OPCs成骨分化。通过生物信息学分析、免疫荧光和Western-blot检测重组CRP对OPCs原纤毛的影响。生物信息学表明原纤毛是参与成骨分化过程的重要细胞器,并且其在OPCs成骨分化过程中异常激活了原纤毛的形成。CH（Chloral hydrate,水合氯醛）处理重组CRP处理组OPCs细胞,OPCs细胞原纤毛表达明显被抑制,几乎不可见（p<0.001）。Western-blot对对照组、重组CRP处理组和水合氯醛处理重组CRP处理组的胶原蛋白1和骨桥蛋白（OPN）表达量测定发现,水合氯醛的加入挽救了因重组CRP加入导致的OPN的减少（p<0.001）。这些数据表明炎症因子CRP通过细胞原纤毛发挥其抑制成骨细胞的增殖与成骨分化作用,提示抑制原纤毛或阻断炎症因子的释放可以治疗炎症引起的骨丢失疾病。第二部分:胃癌致骨丢失及分子机制研究癌症相关骨病是癌症后期高风险并发症,伴随疼痛、骨丢失和骨折。然而,原发性或非骨转移性胃癌是否会诱发骨丢失仍不清楚。我们用人胃癌细胞系HGC-27细胞（1×107cells/m L）注射BALB/c裸鼠,90天后,处死裸鼠收集股骨,通过免疫荧光检测原纤毛表达情况。体内实验结果显示,骨组织acetylatedα-tubulin和γ-tubulin荧光强度处理组比正常组明显增多,表明受到胃癌细胞刺激后,骨组织的原纤毛变长变多（p<0.05）。对正常BALB/c裸鼠骨组织β-catenin和acetylatedα-tubulin进行免疫荧光共染色,结果发现两种蛋白表达位点高度重合。注射HGC-27细胞后裸鼠骨组织中β-catenin比正常骨组织表达显著增加（p<0.001）,而磷酸化β-catenin的蛋白表达量比正常骨组织表达量显著减少（p<0.001）。此外,将MSC细胞随机分为非共培养组和HGC-27共培养组,通过平板克隆、Ki67和PCNA免疫荧光检测各组细胞的增殖活性。结果显示,与非共培养组MSC细胞相比,与HGC-27细胞共培养后的MSCs细胞增殖活性明显降低（p<0.001）。将HGC-27细胞与3种成骨前体细胞（MC3T3-E1、MSCs和OPCs）用成骨诱导培养基共培养16天后进行茜素红染色,三种成骨前体细胞与HGC-27共培养后,不见钙离子沉积,正常成骨前体细胞可见显著的钙离子沉积（p<0.001）。Western-blot检测与SGC-7901共培养的MSCs细胞成骨分化标志蛋白ALP和OPN蛋白表达量比MSCs培养组均明显下降（p<0.001）;OCN蛋白免疫荧光实验,同样证实了上诉结果（p<0.001）。qRT-PCR检测也得到了相同的结论（p<0.05）。HGC-27细胞与MSCs细胞共培养后,MSCs细胞的β-catenin和Wnt3a荧光强度与对照组相比显著增加（p<0.01）。同时,我们观察到β-catenin聚集在细胞质,并逐渐向细胞核转移的现象。接下来,我们增加了GES-1（人胃正常黏膜上皮细胞系）+MSCs细胞共培养组,CH处理的HGC-27细胞+MSCs细胞共培养组进行免疫荧光染色以分析原纤毛表达情况。结果表明HGC-27细胞共培养后的MSCs细胞acetylatedα-tubulin和γ-tubulin比单纯培养的MSCs免疫荧光强度增强（p<0.001）,原纤毛变长变多;而GES-1与MSCs细胞共培养组,MSCs细胞的原纤毛几乎没有明显改变;CH处理的HGC-27与MSCs细胞共培养组,MSCs细胞原纤毛表达明显被抑制,几乎不可见（p<0.001）。Western-blot检测acetylatedα-tubulin和γ-tubulin表达量也得到相同结论（p<0.01）。对于相关信号通路的表达,通过Western-blot测定Naked1,Axin1和β-catenin蛋白发现,HGC-27与MSCs细胞共培养组中MSCs细胞的β-catenin显著增加（p<0.01）,但Naked1和Axin1蛋白显著降低（p<0.01）;经CH处理后,β-catenin蛋白表达显著下降（p<0.001）,其他蛋白无统计学差异。DKK1处理HGC-27与MSC细胞共培养组与未经DKK1处理HGC-27与MSC细胞共培养组比较,acetylatedα-tubulin和γ-tubulin免疫荧光染色荧光强度,原纤毛长度及数量均无统计学差异;Western-blot检测acetylatedα-tubulin和γ-tubulin蛋白表达量也得到相同结论;加入DKK1后,β-catenin在细胞核中的富集度明显降低,Wnt3a的荧光强度也明显减弱（p<0.05）。Western-blot测定Naked1,Axin1和β-catenin的蛋白表达,结果发现DKK1挽救了HGC-27细胞对MSCs产生的影响。q RT-PCR检测Wnt3a,β-catenin,TCF1和GSK-3β发现HGC-27与MSCs细胞共培养后,MSCs细胞的Wnt3a和β-catenin的m RNA转录水平比单纯培养的MSCs细胞升高（p<0.05）,但TCF1和GSK-3β的m RNA转录水平共培养组与单纯培养的MSCs细胞组相比显著下降（p<0.05）,DKK1挽救了HGC-27对MSCs细胞的作用（p<0.05）。将MSC组、HGC-27细胞+MSC细胞共培养组和DKK1+HGC-27细胞+MSC细胞共培养组共三组用成骨诱导培养基诱导16天后进行茜素红染色,结果发现DKK1挽救了因HGC-27细胞导致的成骨分化丢失（p<0.001）。同样,免疫荧光显示,DKK1挽救了HGC-27引起的OCN蛋白表达降低（p<0.001）;Western-blot显示OPN和ALP蛋白表达（p<0.001）、ALP活性（p<0.001）以及q RT-PCR检测ALP和OCN的m RNA水平（p<0.05）表达部分恢复,以上实验都证明DKK1部分削减HGC-27细胞抑制MSCs细胞成骨分化的能力。这些结果表明,胃癌在发生骨转移之前骨组织已遭到破坏。在HGC-27细胞的影响下,MSCs细胞的原纤毛形成增加,这与Wnt/β-catenin通路的异常激活有关。DKK1抑制Wnt/β-catenin信号通路,削弱HGC-27细胞抑制MSCs细胞成骨分化的程度。综上所述,我们的研究结果表明,胃癌细胞可能通过原纤毛依赖性激活Wnt/β-catenin信号通路,在骨转移发生前造成骨丢失。