2006年3月，广东省出现第一例人感染H5N1禽流感病毒并死亡的病例，为了追踪该病毒(A/China/GD01/06，简写为GD01/06)的可能来源，探讨其致病机制以及遗传、进化与变异的特征，为研制适合我国人群的H5N1人禽流感病毒疫苗及制定预防措施提供科学依据。本研究从该患者尸检肺组织扩增和克隆GD01/06全基因组序列，并运用多种生物学软件对GD01/06及其他H5N1禽流感病毒基因序列进行全面的比对分析。同时构建H5N1人禽流感病毒样颗粒，作为高致病性H5N1人禽流感病毒的替代模型，以便下一步在普通实验室广泛而安全地开展H5N1人禽流感病毒结构与功能、抗原性以及病毒与细胞的相互作用等研究。 方法：应用RT-PCR技术从患者尸检肺组织中扩增GD01/06全基因组8个基因片段，将扩增的基因片段分别克隆到pGEM-T载体并进行序列测定。测序结果应用DNAStar软件包中MapDraw、EditSeq进行编辑和拼接，利用软件包中的Protean程序分别推导出氨基酸序列，分析GD01/06核苷酸和氨基酸的改变。并在3D-JIGSAW蛋白质结构数据库对HA和NA蛋白空间结构进行在线预测，分析其氨基酸的改变对蛋白结构和功能的可能影响。 分别将GD01/06 8个基因序列在NCBI BLAST Server上进行在线比对，并从NCBI流感病毒基因组数据库下载各个地区、不同时间、不同宿主分离的H5N1禽流感病毒以及其他流感病毒基因序列，用Clustal X软件进行序列多重比对，MEGA3.1软件构建系统进化树。分析GD01/06可能的来源，H5N1禽流感病毒的遗传与进化特征。 将GD01/06 HA基因、Ml基因的编码区序列分别重组到表达载体pMT/Bip/V5-His B上。将重组质粒pMT/Bip-M1与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞，Blasticidin筛选稳定多克隆细胞株。同时将重组质粒pMT/Bip-M1、pMT/Bip-HA与筛选质粒pCoBlast三质粒共转染果蝇S2细胞，Blasticidin筛选稳定多克隆细胞株。稳定多克隆细胞株培养后加入不同浓度CuSO4诱导重组蛋白的表达，分别收集不同诱导时间的培养上清和细胞，用SDS-PAGE、WB、Dot blot、间接免疫荧光等技术检测M1、HA蛋白表达。挑选高表达M1、HA蛋白的稳定多克隆细胞株进行培养，细胞上清浓缩后经蔗糖密度梯度离心纯化，免疫电镜负染观察上清中病毒样颗粒。细胞固定、包埋后制作超薄细胞切片，电镜观察细胞中病毒样颗粒。 结论 1、GD01/06 8个基因片段均为禽源性的，这株病毒没有与人流感病毒发生基因重组，直接由禽类传给人。 2、GD01/06 HA1蛋白RBD位点氨基酸高度保守，与受体结合有关位点(第75、123、139、167、182、192、193、223)的氨基酸残基也没有发生突变，具有与禽细胞表面SAα2，3Gal受体结合的分子基础。 3、GD01/06 HA蛋白在裂解位点氨基酸序列为PLRERRRKR/GLF，由6个碱性氨基酸组成，并在第154～156处增加一个糖基化位点。同时其NS1蛋白第92位氨基酸发生变异(Asp→Glu)。这些分子特征可能与该病毒株高致病性有关。 4、H5N1禽流感病毒8个基因片段的进化特征分析表明，各基因在宿主分化方面没有显著的特点，但各基因具有明显的时间分化特征，而且2003年以后分离株根据地域不同形成4个亚系：VTM亚系、IDN亚系、Eurasia-Africa亚系、China亚系。这些结果提示在H5N1人禽流感病毒疫苗研究及应用时要充分考虑其在时间和地域方面的特征。 5、利用果蝇S2细胞表达系统成功构建了H5N1禽流感病毒样颗粒。构建的病毒样颗粒为下一步H5N1人禽流感疫苗以及诊断学研究奠定了基础。 6、构建的病毒样颗粒可作为高致病性H5N1人禽流感病毒的替代模型，研究H5N1人禽流感病毒结构与功能、病毒与细胞相互作用等。