生物质谱在蝎毒素蛋白质组学中的应用及其蛋白质翻译后修饰检测研究

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蛋白质组学作为后基因组时代新出现的一门学科。它以大规模的蛋白质鉴定为基础,以蛋白质翻译后修饰检测为其重要动力。蛋白质组学为人们系统地了解生物过程提供了一套重要的手段。蛋白质组学的三大核心支撑平台分别为:样品制备及分离平台;质谱检测平台;生物信息学平台。与三大核心支撑平台相关的研究都取得了显著的进步。随着研究的深入,为了对微量蛋白质进行定性和定量的研究。各种富集方法在生物研究中得到广泛的应用;同时也推动了高精度质谱仪器的出现;对于产生的大量数据,各种生物信息学手段在生物研究中被广泛的使用。这些科研成果都很大程度上推动了系统生物学的发展。本论文主要是基于蛋白质组学的手段在两个方面开展了相关的研究:1)利用蛋白质组学中的技术方法,对东亚钳蝎和亚洲雨林蝎进行了蛋白质水平上的验证工作;同时将转录组学的研究手段和蛋白质组学的研究技术相结合。对尚未开展深入研究的亚洲雨林蝎进行了多肽水平的验证,并且对多肽的生物功能进行分类;2)对蛋白质的翻译后修饰开展了相关的研究,如磷酸化多肽的富集和检测;基于质谱方法及MIDAS方法,开发关于蛋白质翻译后硝基化修饰的检测方法。在我国将蝎入药已经有上千年的历史。通过现代科学技术的研究,我们已经初步了解了一些蝎毒素的药用机理。部分毒素多肽已经作为新药进入临床前的试验。通过以往的研究,我们发现蝎毒素组分复杂,没有合适的分离手段很难对其中的微量毒素进行深入的研究。随着蛋白质组学的发展,与之相关的色谱分离技术和质谱检测方法的出现,都为研究蝎毒素提供了更好的平台。本论文中,我们以蛋白质组学中的色谱分离技术和质谱检测技术,对东亚钳蝎和亚洲雨林蝎毒素,在蛋白质水平上进行了全面的分析。我们采用多维色谱分离技术对全蝎毒素进行色谱分离。得到的单一多肽通过Edman降解的手段对其氨基酸序列进行测序;其他混合组分通过MALDI-TOF质谱仪器对多肽分子量进行统计。另外,我们也通过电泳和不同的质谱检测方法,对不同种属蝎毒素的多肽分布信息进行综合的比较。我们将蛋白质组学和转录组学相结合,对尚未得到充分研究的亚洲雨林蝎进行系统、深入的研究。我们通过转录学的手段建立了亚洲雨林蝎毒素高质量,完整的cDNA文库。通过cDNA文库的信息我们得到了相应的蛋白质数据库,利用蛋白质组学中的"bottom-up"的研究方式。我们在多肽水平上对雨林蝎毒素库进行了验证工作,并且将其中的多肽进行了功能分类。这些工作都为新药的筛选和蝎毒素研究提供了新的研究思路。而后期我们开发的在线多维色谱质谱联用平台,将为微量毒素研究提供可行性。蛋白质翻译后修饰参与各种调控机制过程,例如信号传导,细胞分化及其代谢等。而其中的磷酸化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰,参与调控细胞的增殖、分化和凋亡,从而引起了人们广泛的关注。我们对基于质谱检测平台的磷酸多肽富集材料进行了初步的探索,比较了两种不同磷酸化富集材料的选择性。通过对合成条件和洗脱条件的优化,我们可以检测到更多的磷酸化肽段。对于硝基化多肽尚无特别合适的富集材料,我们利用MIDAS和SKYLINE两个软件,对硝基化多肽修饰位点检测方法进行了优化,为将来对其他微量修饰的检测做了质谱方法学上的探究。
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