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核盘菌是油菜上的重要病原真菌,严重影响油菜的产量和品质,由其引起的菌核病目前仍然没有理想的防治措施。真菌病毒侵染后,核盘菌EP-1PN菌株的表型发生了显著的改变,包括致病力衰退、生长缓慢和菌落形态异常等。这些表型的变化是核盘菌基因表达发生变化的反映,研究这些基因及其表达,有助于深入理解核盘菌的致病机理,建立新的防治策略。为了鉴定出这些差异表达的基因,本研究以感染真菌病毒的弱毒株EP-1PN和它的子囊孢子单孢分离物—强毒株EP-1PNAa为材料进行了以下研究: 以EP-1PNAa的mRNA为材料建立了cDNA噬菌体文库,该文库的滴度约为10~9pfu/ml,空斑率为2.4%。 以弱毒株EP-1PN的不同生长时期的mRNA反转录cDNA作为探针,与构建的不同生长时期的核盘菌强毒力菌株EP-1PNAa(弱毒株EP-1PN的单孢分离物)的cDNA噬菌体文库进行杂交,挑选出差异表达的克隆1116个。 将插入片段大于1000bp的克隆(210个)进行测列分析,并在NCBI上将这些序列进行nr数据库的BLASTX相似性搜索,去除重复之后,139个克隆的序列与该数据库的序列具有一定程度的相似性,12个序列在数据库中没有相似性序列存在。根据比较结果将推定的不同功能的基因按照MIPS基因功能分类方法进行了分类。从功能的分类结果上看,被抑制表达的克隆所代表的基因功能涉及到代谢、能量、转录、蛋白合成、蛋白命运、物质运输、液泡运输、信号传导、细胞骨架生物合成、细胞防御、细胞骨架排列以及未分类蛋白等12类。其中可能与核盘菌和其它病原菌致病过程相关的克隆主要有三类:细胞防御、蛋白命运和信号传导,占总克隆的20%。 在此基础上,对所获得的210个克隆进行了反向Northern和部分基因的Northern杂交分析。反向Northern结果显示挑选的克隆与强毒株mRNA探针杂交时绝大多数均有信号,而与弱毒株mRNA探针杂交时极少数才有信号。表明差异筛选具有较高的可靠性,同时说明真菌病毒影响寄主基因表达的广泛性。选取其中的18个克隆进行了不同时期RNA表达水平的Northern杂交检测,其中12个(66%)克隆的表达在强毒,弱毒株之间表现出明显的信号差异,即强毒株中有显著的信号,而弱毒株中杂交信号弱或无信号,表明这些克隆所代表的基因在病毒侵染的核盘菌弱毒株中被抑制表达。这12个克隆包括核盘菌重要的致病相关因子内源多聚半乳糖醛酸酶(endopolygalacturonase),在M.grisea及其它病原真菌和动植物中参与毒力形成的亲环素(Cyclophilin)及在Blumeria graminis和M.grisea等中参与真菌与寄主互作的aldo-keto reductase homologue。其它还包括参与蛋白调节作用的锌指蛋白(zinc-finger protein),能量合成相关磷酸甘油酸酯激酶(Phosphoglycerate kinase)