本研究以兔为材料,系统地研究了不同培养条件和传代方法对兔类ES、EG细胞分离培养的影响,为完善兔类ES、EG细胞建系的技术路线提供资料。实验主要结果如下:1试验比较不同饲养层和不同培养液对ES细胞分离培养的影响。选用DMEM+15%FBS+0.1mMβ-巯基乙醇+0.1mM MEM+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+1000IU/ml LIF+10mg/mL胰岛素作为体外分离培养家兔ES细胞的培养液,胚胎能较快贴壁、增殖,兔类ES细胞最高能够传至5代而不分化。无饲养层培养与在MEF、REF饲养层中培养的家兔胚胎贴壁率,ICM增殖率之间有极显著差异(P<0.05),几乎不能传代。MEF作为饲养层,胚胎的贴壁率为67.4%,最高传代至第5代;以REF为饲养层胚胎的贴壁率为63.2%,最高传至第4代。2本试验对ICM和类ES细胞集落采用三种不同的传代方法进行传代,结果发现,连续消化法相对一次消化法ES细胞克隆的比率大为提高,连同饲养层一起消化产生ES克隆的比率太低,ES细胞只传1代,不适合用作ES细胞的早期分离、传代。3 14～18d胎龄的兔胎儿均能分离得到PGCs原代集落,但是15、16d的胎儿分离得到的集落数要比14、17、18d胎儿得到的集落要多,类EG细胞最高传了9代,适合克隆兔类EG细胞。SD大鼠心肌条件培养基能够较好地促进兔PGCs的分离培养,与添加LIF组差异不显著(P>0.05),但明显好于未添加LIF组,可以用于兔PGCs的分离培养。4将取得的兔PGCs分别培养在MEF﹑REF饲养层上或与同源兔胎儿生殖脊成纤维细胞(HEFgr)﹑兔睾丸支持细胞(RSC)共培养。结果表明,采用共培养的模式分离得到的集落明显多于传统的饲养层模式。与RSCs共培养得到的EG细胞集落数最多,保持未分化的时间最长,并传了8代,与HEFgr共培养得到的EG细胞集落数与RSCs相比差异不明显,但最高只传了6代。培养在MEF上的兔类EG细胞也能较好的保持未分化状态,传了4代。培养在REF上的兔类EG集落数目较少,出现分化时间较早,只传了3代。因此可以用与RSCs或HEFgr共培养的方法分离培养兔PGCs。5试验比较了不同传代方法对兔类EG细胞传代的影响,结果发现手工传代和连同饲养层细胞一起消化传代法均获得了较高的P1集落数,两者差异不显著,但手工传代EG集落能够传至第9代,而连同饲养层细胞一起消化只能将EG细胞传至第4代,不适合作为兔类EG细胞传代的方法。6分离得到的兔ES、EG细胞,经形态学观察、AKP染色、体外分化能力检测实验等,证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。