猪链球菌靶向DCs重组亚单位疫苗DC3pep-SDZ的构建与免疫保护性分析

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本研究的目的是为了研制针对2、3、9等高致病血清型猪链球菌(Streptococcus suis,SS)的通用且有效的重组亚单位疫苗。首先本研究利用了多种生物信息学软件对高致病型SS高度保守的分泌型DNA核酸酶A(Ssn A)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH)和锌转运蛋白(Znu A)3种毒力因子进行综合分析,预测并获得了3个毒力因子具有亲水和较好抗原性的B/Th细胞表位。后将各优势表位串联,设计出多表位重组蛋白SDZ的氨基酸序列;将十二聚体树突状细胞靶向肽(DC3pep)与优势表位串联,设计出了与树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)具有靶向结合潜力的多表位重组蛋白DC3pep-SDZ的氨基酸序列。蛋白质理化分析两个氨基酸序列,结果显示SDZ与DC3pep-SDZ蛋白分子质量分别约为42 ku和44 ku,理论等电点(p I)为4.5和4.65,平均亲水性(GRAVY)为-0.4436和-0.462,均属于亲水蛋白。构建重组原核表达载体p ET28a-SDZ与p ET28a-DC3pep-SDZ,转化感受态细胞后经IPTG诱导,两种重组蛋白大量于上清中表达,且均经200 mmol/L咪唑流穿亲和层析镍柱时得到了纯化,SDS-PAGE结果显示得到了42 ku和44 ku的目的蛋白,超滤浓缩后的重组蛋白浓度分别达到了4.90 mg/m L和5.60 mg/m L。利用不同浓度重组蛋白对2%猪红细胞悬液进行体外溶血试验,检测得到了5~500μg/m L蛋白浓度范围内,重组蛋白SDZ与DC3pep-SDZ对猪红细胞悬液溶血率均低于5%;利用不同浓度重组蛋白对PK15和IPEC-J2细胞进行孵育,CCK-8试剂检测得到了在500μg/m L的重组蛋白SDZ和DC3pep-SDZ孵育下的PK15与IPEC-J2细胞相对增殖率可以分别达到97.3%和99.8%、98.5%和99.6%,表明了两个重组蛋白均无明显的细胞毒性;将重组蛋白SDZ与DC3pep-SDZ分别免疫健康斑马鱼与小鼠进行安全性评价,7日后免疫两种重组蛋白的斑马鱼与小鼠均无不良反应,且健康状态良好。重组蛋白SDZ与DC3pep-SDZ具有安全性。将两个重组蛋白对成年健康斑马鱼免疫3次后,攻击高致病2、3和9型SS(SS2、SS3和SS9),计算免疫保护率并观察斑马鱼脑组织的病理切片,最后利用q PCR检测SS3攻击后的斑马鱼脑组织中炎性细胞因子表达差异。结果显示重组蛋白DC3pep-SDZ对于斑马鱼感染SS2、SS3、SS9的保护率均高于SDZ达到了50%,65%和60%。重组蛋白DC3pep-SDZ能更优于SDZ较对照组极显著降低促炎性细胞因子IL-6、TNF-α基因,上调抗炎性因子IL-10和TGF-1β基因的表达水平。最后将重组蛋白SDZ与DC3pep-SDZ与弗氏佐剂混合制备亚单位疫苗,3免后利用ELISA检测小鼠抗体效价水平、细胞因子浓度,并以SS3攻击小鼠,检测脏器与血液载菌量、小鼠的存活情况等。结果显示两种疫苗均产生了对小鼠的免疫保护力,其中免疫亚DC3pep-SDZ+CFA/IFA的小鼠血清抗体效价高于免疫SDZ+CFA/IFA达到了1:102400,相较与对照组免疫DC3pep-SDZ+CFA/IFA极显著地提升细胞因子IL-6与IFN-γ浓度达到了34.7 pg/m L和228.6 pg/m L,对SS3攻击的小鼠保护率高于SDZ+CFA/IFA达到了75%。综上结果表明,构建的靶向DCs重组蛋白DC3pep-SDZ较表位重组蛋白SDZ有着更好的免疫原性,DC3pep-SDZ+CFA/IFA疫苗较SDZ+CFA/IFA疫苗能更好的激发体液与细胞免疫,为成为一种有效的高致病型SS通用亚单位疫苗奠定基础。
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