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疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)是一种嗜碱性、热稳定脂肪酶。TLL与其它嗜热真菌脂肪酶相比,具有更高的催化效率。目前,TLL已被Novozymes公司制成商品化脂肪酶Lipolase(?)和Lipozyme TLIM(?),广泛应用于食品、洗涤、生物柴油和精细化学品工业等不同领域。近年来,随着绿色制药的兴起,TLL在手性医药中间体制备中的应用越来越多。利用Lipolase(?)选择性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸,可用于“重磅炸弹药物”普瑞巴林的生产。因此,提高TLL水解CNDE的催化活力对普瑞巴林的生产具有重要意义。本论文在实验室已构建的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET28b-TLL的基础上,根据已报道的该酶晶体结构,对酶和底物结合过程进行计算机模拟。分析和选择了 6个位于活性中心附近的氨基酸残基(Glu56,Ser58,Trp89,Ile202,Va1203,Leu259),三个位于盖子转角位点(Ser83、Asn94,Leu96),以及两个可能影响二硫键形成的位点(Ala20,Tyr21)作为突变靶位点。以质粒pET28b-TLL为模板,设计饱和突变引物,利用全质粒扩增技术,构建突变文库。利用溴百里香酚蓝pH指示剂进行高通量初筛,并用气相色谱进一步复筛,得到水解CNDE活力明显提高的突变体S83T和S58L/S83T。利用硫酸铵分级沉淀、疏水作用层析和离子交换层析对诱导表达的野生型TLL及突变体脂肪酶进行分离纯化,获得了电泳纯的酶蛋白。对突变前后酶的比活力进行测定,突变体S83T、S58L/S83T的比活力分别是原始菌株的2.69和5.46倍,kcat/Km值分别是原始菌株2.97和7.18倍。结果表明,突变后的催化效率明显提高。突变后的最适温度由突变前的45℃提高为50℃,且热稳定性好,在40℃条件下,半衰期达22.5 d。突变前后酶的最适pH没有发生改变,均为pH 9.5,在pH稳定性研究中,发现突变酶在碱性条件下稳定性较好,在pH 9.0条件下放置26 d后,残余酶活仍保持60%。利用同源建模和分子对接技术分析了突变体活力提高的机理。当苏氨酸取代83位丝氨酸残基后,83位氨基酸残基的β-OH和底物CNDE的羰基氧形成的氢键键长由原来的2.8 A缩短为1.9 A,有利于维持酶-底物中间过渡态,从而提高酶活。58位丝氨酸残基被亮氨酸取代后,可能会促进Arg84 NH-OD Asp57氢键断裂,盖子由关闭到打开,使底物和活性中心充分接触。考察了突变体S58L/S83T静息细胞催化CNDE的反应条件。确定了较优的反应体系:Tris-HCl,pH 8.0,最适反应温度为40℃,Ca(OAC)2添加浓度为150 mM。在优化条件下,5%(w/v)突变体S58L/S83T静息细胞催化3 M CNDE 24 h后,产物浓度达到1344 mM,e.e.p>96%,已达到8%(w/v)商品化酶Lipolase(?)动力学拆分CNDE的效果。