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目的:
我们前期研究发现,出生后间歇性低压低氧暴露能够增强小鼠空间记忆,但同时损害联合记忆。已知低氧能够诱导神经发生,而转录因子Pax6(pairedhomebox6)在胚胎神经系统发育过程中能够调节神经细胞的增殖和分化。因此本研究观察出间歇性低氧对新生小鼠脑神经发生和Pax6表达的影响,以期探明其对记忆影响的神经机制。
材料和方法:
新生小鼠出生后立即分别暴露于模拟高原海拔2千米(16.0％O2;PaO2,60mmHg)和5千米(10.8％O2;PaO2,41mmHg)低压低氧环境,每天低氧暴露4小时,连续低氧4周。低氧结束后小鼠常氧环境分组饲养1周和4周。对照组为不低氧暴露小鼠(设为海平面,21％O2)。为了观察神经发生情况,低氧结束后连续3天注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU),每天一次;为了观察新生神经细胞是否能够与原有神经细胞建立联系,每组小鼠在处死前2小时给予足底电刺激,免疫荧光方法用来观察BrdU和c-fos在脑内的表达情况并进行定位分析;为了观察低氧对Pax6表达的影响,分别用免疫荧光和western-blot技术对Pax6在脑内表达情况进行定位和定量分析。
结果:
1.低氧对神经发生的影响
(1)与对照组相比,低氧暴露4周小鼠在脑内OV、LV、pir、Or、DG、门、丘脑和运动皮质等区域存在BrdU阳性细胞,而且2千米低氧处理组的BrdU阳性细胞明显比5千米低氧处理组的BrdU阳性细胞多。
(2)进一步研究发现,BrdU与NeuN和GFAP都共存。
(3)BrdU阳性细胞可以持续存活到低氧结束后4周。
(4)低氧结束后4周,发现c-fos表达于新生的NeuN阳性细胞。
2.低氧对Pax6表达的影响
(1)在正常对照30天龄小鼠中,Pax6在多个脑区表达,包括OV、VBD、VP、LV、pir、M、aca、Tu、LSI、LSV、BSTLD、MPOM、LPO、3V、Pe、LH、VMH、BLA、BMA、Aco、BLV、st、LDVL、MGP、VMHDM、alv、Or、PLCo、PMCo、Mtu、BSTAI、MePD、MePV、PH、ns、ec、Astr、BMP、VPM、VM、VPL、DG、Lmol、FC、SubG、RPF、ZIV、ZID、MM。
(2)低氧4周结束后(出生后30天),模拟高原2千米低压低氧处理组表达Pax6的核团有OV、Pir、LV、DG、Mtu、BMP和PLCo;模拟高原5千米低压低氧处理的实验动物中表达Pax6的区域有OV、pir、Or、Tu、M、VDB、LV、VP、LSI、LSV、MPOM、DM、MCPO、PLCo、MGP、Pe、LH、VMH、BMA、BLA、LDVL和MePD。
(3)低氧暴露4周后,Pax6与NeuN和GFAP都共存表达,并且小鼠脑内可见Pax6与BrdU共染。
(4)Western-blot定量结果显示:①横向比较发现,在低氧结束后和低氧结束后1周,与对照组比较,2千米和5千米低氧暴露小鼠(244,544和245,545表示)的Pax6表达量显著减少;②纵向比较低氧结束后、低氧结束后1周和低氧结束后4周小鼠发现,对照组、2千米低氧组和5千米低氧组脑内Pax6的表达量都逐渐增加。相对于对照组的增加,5千米低氧出生后8周处死实验动物(548表示)Pax6表达量比对照组8周处死实验动物(048表示)显著增多。
结论:
1.出生后间歇性低压低氧暴露可以促进小鼠脑神经发生,这种新发生的细胞可以同时分化为神经细胞和星形胶质细胞。新发生的细胞可以长时间存活,并可与已有的成熟神经细胞建立神经环路连接。
2.出生后脑内仍然有大量脑区的神经细胞和胶质细胞都表达Pax6。出生后低氧显著减少Pax6在脑内多个区域的表达。
3.在低氧暴露小鼠脑内,Pax6可见与BrdU共同表达于NeuN阳性细胞,提示Pax6可能参与了低氧诱导神经细胞的发生。