1目的从临床数据挖掘、临床观察及体外细胞实验三个方面观察痛风性关节炎急性期患者(AGA)氧化应激、炎症反应、生活质量、AMPK信号通路等相关实验室指标的变化及HQC对其的影响,并基于AMPK信号通路探讨HQC改善AGA患者氧化应激及炎症反应的机制。2方法2.1数据挖掘研究运用安徽中医药大学第一附属医院病例采集系统软件调取2012年5月至2017年10月就诊于我院的AGA(湿热蕴结型)患者。应用我院信息中心自主研发的临床数据挖掘系统。采集住院病人的一般资料、中药使用情况及实验室检查等相关信息,建立“安徽省中医院风湿病科数据中心”。采用SPSS 22.0和SPSS Clementine11.1软件的Aprior模块对以上数据进行分析。2.2临床研究观察60例AGA患者年龄、性别、病程,关节及全身症状积分值,生活质量积分值等实验室指标情况。采用ELISA法检测外周血清IL-6、IL-4、IL-10、TNF-α、IL-1β、SOD、MDA、LPO、TAOC、PPARγ、CD36、AMPK、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD的水平;采用流式细胞术检测外周血单核细胞CD36的表达;采用RT-PCR检测PPARγ、AMPK、FoxO3a基因表达;采用蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测人体外周血液中PPARγ、AMPK、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白表达;采用魏氏法检测ESR;采用日立HITACHI7060全自动生化仪检测其他生化指标;采用全自动血细胞分析仪(XT2000型)检测血常规;AGA患者症状体征积分值,VAS评分采用问卷调查的方式进行观察、记录。采用SPSS22.0统计软件分析氧化应激及炎症反应相关指标与上述指标之间的关系。将所选60例住院患者按随机数字表分为治疗组(黄芩清热除痹胶囊组,30例)和对照组(美洛昔康组,30例),观察两组治疗前后的氧化应激相关指标(SOD、TAOC、MDA、LPO),关节、全身症状体征积分值,VAS评分,细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10),AMPK信号通路指标的改善情况。2.3体外实验研究收集AGA患者外周抗凝血,按步骤分离出PBMC。加入含血清的完全1640培养基培养,置于37℃、5%CO2培养箱中,待细胞贴壁培养24h后,加入不同剂量的HQC,于24h后收集细胞,提取RNA,用荧光定量PCR检测AGA患者外周血单核细胞PPARγmRNA、AMPK-α1mRNA、FoxO3amRNA、MnSODmRNA的表达;用蛋白免疫印迹法(WB)检测AGA患者外周血单核细胞PPARγ、AMPK-α1、p-AMPKα1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白的表达;同时收集细胞上清,用ELISA检测IL-1β、IL-4、SOD、TAOC、LPO、MDA的表达水平。3结果3.1 598例AGA患者临床数据挖掘研究结果3.1.1中药使用情况598例患者共涉及300余味中药。出现频率最高的20味中药多集中在健脾利湿药、清热药、理气药、活血化瘀药、补虚药五大类。3.1.2药物的关联分析应用关联规则挖掘两药功效之间的关联,将健脾利湿药、清热药、活血化瘀药、祛风除湿药、补虚药、理气药进行关联。最小支持度和置信度分别为20%与70%。置信度最高的三个药对为:祛风除湿药和清热药(100%),健脾利湿药和祛风除湿药(100%),健脾利湿药和清热药(99.83%);将出现频率最高的20味药物进行关联,置信度最高的三个药对为:桃仁和红花(98.47%),山药和薏苡仁(94.94%),泽兰和泽泻(94.17%)。3.1.3药物的聚类分析使用SPSS 22.0对使用频数较高的药物进行聚类分析,得出健脾利湿、清热解毒、活血化瘀、祛风除湿四类药物配合应用为治疗AGA的大法。3.2治疗前临床研究结果3.2.1 AGA患者氧化应激、细胞因子、信号通路相关指标的变化与健康对照组比较,AGA患者各参数明显异常。反应机体抗氧化能力的指标SOD、TAOC的表达量较健康对照组明显降低;反应机体过氧化的指标MDA、LPO的表达量较健康对照组明显升高(P<0.01);促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6较健康对照组明显升高,抑炎因子IL-4、IL-10较健康对照组明显降低(P<0.01);AMPK、FoXO3a、p-FoXO3a、PPARγ、MnSOD、CD36的表达较健康对照组明显降低(P<0.05或P<0.01)。3.2.2 AGA患者外周血PPARγ、AMPK、FoxO3a相关基因的表达的变化采用RT-PCR分别检测12例AGA患者及6例健康人PPARγmRNA、AMPK-α1mRNA及FoxO3amRNA的表达,结果发现AGA活动期患者的PPARγmRNA、AMPK-α1mRNA及FoxO3amRNA的表达较正常组均有所降低(P<0.01)。3.2.3 AGA患者外周血PPARγ、AMPK-α1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD相关蛋白表达的变化采用WB分别检测10例AGA患者及5例健康对照组PPARγ、AMPK-α1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白的表达,结果发现AGA活动期患者的PPARγ、AMPK-α1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白的表达较正常组均有所降低(P<0.05或P<0.01)。3.2.4 AGA患者外周血单核细胞CD36荧光强度的变化采用流式细胞术检测健康对照组(5例)与AGA患者(10例)外周血单核细胞CD36荧光强度的表达水平。AGA患者单核细胞CD36荧光强度明显低于健康对照组(P<0.05或P<0.01)。3.2.5 AGA患者其他实验室指标的变化与健康对照组相比较,AGA患者存在多种免疫指标、炎症指标等的异常(P<0.05或P<0.01)。3.2.6 AGA患者氧化应激指标与细胞因子及通路指标的相关性分析相关性分析显示,SOD与TNF-α呈负相关,与AMPK、PPARγ、MnSOD呈正相关;TAOC与AMPK、CD36呈正相关;MDA与IL-10、AMPK、FoXO3a、p-FoxO3a、PPARγ、MnSOD均呈负相关,与IL-1β呈正相关;LPO与FoXO3a、p-FoxO3a、MnSOD、CD36呈负相关(P<0.05或P<0.01)。3.2.7 AGA患者细胞因子与通路指标的相关性分析相关性分析显示,AMPK与IL-6呈正相关,与TNF-α呈负相关;FoXO3a与TNF-α呈负相关;p-FoXO3a与TNF-α呈负相关;PPARγ与IL-4、IL-10呈正相关,与TNF-α呈负相关;MnSOD与IL-4、IL-10呈正相关,与TNF-α呈负相关;CD36与IL-4、IL-10呈正相关(P<0.05或P<0.01)。3.2.8 AGA患者氧化应激指标与部分实验室指标的相关性分析相关性分析显示,SOD与UA、ESR、hs-CRP呈负相关,与IgA呈正相关;TAOC与ESR、CRP呈负相关;与CD36呈正相关,MDA与α1-AGP呈正相关;LPO与hs-CRP呈正相关(P<0.05或P<0.01)。3.2.9 AGA患者氧化应激指标与症状量化积分、VAS评分之间的相关性分析相关性分析显示,LPO与关节疼痛呈正相关(P<0.05或P<0.01)。3.2.10两组临床疗效比较治疗后,对照组与治疗组总有效率分别为90%、96.7%,经卡方检验得出治疗组的总有效率高于对照组(P<0.05);治疗组显效率(60.0%),高于对照组(43.3%)(P<0.05)。3.2.11两组治疗前后氧化应激指标、细胞因子及通路相关指标的变化比较与治疗前相比,两组SOD、TAOC均有所上升,MDA、LPO均有所下降(P<0.01或P<0.05);两组治疗后相比较,治疗组TAOC升高更为明显,LPO降低更为明显(P<0.05);两组IL-4、IL-10均有所上升,IL-6、IL-1β、TNF-α均有所下降(P<0.01或P<0.05);两组治疗后相比较,治疗组IL-4、IL-10升高更为明显,IL-6、IL-1β、TNF-α降低更为明显(P<0.01或P<0.05);两组AMPK、FoXO3a、p-FoXO3a、PPARγ、MnSOD、CD36均有所上升(P<0.01);两组治疗后相比较,治疗组FoXO3a、p-FoXO3a、PPARγ、MnSOD、CD36升高更为明显(P<0.01)。3.2.12两组治疗前后PPARγ、AMPK、FoxO3a相关基因的表达的变化与治疗前相比,两组PPARγmRNA、AMPK-α1mRNA、FoxO3amRNA的基因表达水平均有所上升(P<0.01或P<0.05);两组治疗后相比较,治疗组PPARγmRNA、AMPK-α1mRNA、FoxO3amRNA的基因表达水平升高更为明显(P<0.01)。3.2.13两组治疗前后外周血PPARγ、AMPK、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD相关蛋白表达的变化与治疗前相比,两组PPARγ、AMPK-α1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD的蛋白表达水平均有所上升(P<0.01或P<0.05);两组治疗后相比较,治疗组PPARγ、AMPK-α1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD的蛋白表达水平升高更为明显(P<0.01)。3.2.14两组治疗前后外周血单核细胞CD36的表达水平及荧光强度的变化与治疗前相比,两组CD36相对荧光强度均有所上升(P<0.01);两组治疗后相比较,治疗组CD36相对荧光强度升高更为明显(P<0.01)。3.2.15两组治疗前后其他实验室指标的变化与治疗前相比较,两组均能改善AGA患者免疫、炎症、氧化应激指标(P<0.01或P<0.05);两组治疗后相比较,治疗组在改善患者部分免疫、炎症、氧化应激指标方面优于对照组(P<0.01或P<0.05)。3.2.16两组治疗前后中医症状积分、VAS评分的变化与治疗前相比较,两组均能改善AGA患者中医症状积分、VAS评分(P<0.01或P<0.05);两组治疗后相比较,治疗组在改善患者中医症状积分(关节疼痛、关节发热、关节屈伸不利)、VAS评分方面优于对照组(P<0.01或P<0.05)。3.3体外实验研究结果3.3.1 HQC含药血清对AGA患者单核细胞细胞因子及氧化应激指标的影响与正常组相比,其余各组的IL-1β、LPO、MDA均高于正常组,IL-4、SOD、TAOC均高于正常组(P<0.01)。与HQC组相比较,阻断剂组LPO、HQC+阻断剂组的MDA均较高(P<0.05),HQC+阻断剂组的SOD、TAOC均较低(P<0.01),与模型组相比较,部分组的IL-1β、LPO、MDA均较低,IL-4、SOD、TAOC均较高(P<0.05或P<0.01)。3.3.2 HQC含药血清对AGA患者外周血单核细胞PPARγmRNA、MnSODmRNA、AMPK-α1mRNA、FoxO3amRNA的影响与正常组相比较,其余各组的PPARγmRNA、MnSODmRNA、AMPK-α1mRNA、FoxO3amRNA的表达均低于正常组(P<0.01),与HQC组相比较,HQC+阻断剂组、阻断剂组的上述指标均较低(P<0.05或P<0.01),与模型组相比较,HQC组、HQC+阻断剂组的上述指标均较高,而阻断剂组的上述指标较空白组低(P<0.05或P<0.01)。3.3.3 HQC含药血清对AGA患者外周血单核细胞MnSOD、AMPK-α1、p-AMPKα1、PPARγ、FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表达的影响与正常组相比较,其余各组的MnSOD、AMPK-α1、p-AMPKα1、PPARγ、FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表达均低于正常组(P<0.01)。与HQC组相比较,HQC+阻断剂组、阻断剂组的上述指标均较低(P<0.01),与模型组相比较,HQC组、HQC+阻断剂组的上述指标均较高,而阻断剂组的上述指标较空白组低(P<0.01)。4结论AGA患者体内存在着氧化应激状态,其具体表现为机体抗氧化能力的下降,并与炎症反应密切相关。HQC在改善AGA患者临床症状的同时,还能够显著改善AGA患者氧化应激及炎症反应状态,并且在临床疗效及改善氧化应激及炎症反应状态的疗效上优于美洛昔康对照组。HQC改善AGA患者氧化应激及炎症反应状态的机制如下:(1)HQC通过上调抗炎细胞因子(如IL-4、IL-10)、下调促炎细胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α),控制炎症反应,恢复机体氧化-抗氧化的平衡,从而改善临床症状。(2)HQC通过刺激PPARγ,上调AMPK信号通路的表达,提高患者抗氧化能力,从而达到改善患者氧化应激及炎症反应状态的效果。