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β-双酮抗生素(DKAs)是假持久性新型污染物之一,污水处理末端的痕量残留是水环境二次污染的主要源头,人们最易忽视其环境效应。氟喹诺酮类(FQs)和四环素类(TCs)抗生素是环境污染物中最常见的两大类β-双酮类抗生素,然而它们对斑马鱼的联合毒性鲜有报道。 在本研究中,以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为实验材料,选取六种广泛使用的β-双酮类抗生素:三种氟喹诺酮类抗生素(环丙沙星、氧氟沙星及恩诺沙星)、三种四环素类抗生素(盐酸强力霉素、盐酸金霉素及土霉素)作为实验药物,研究了FQs与TCs对斑马鱼急性暴毒后孵化率、死亡率、畸形率、行为等生理特征的联合作用。FQs、TCs及DKAs对胚胎的120 hpf半数致畸浓度(EC50)分别是481.3 mg/L、16.4 mg/L和135.1 mg/L。用相加指数法(AI)、毒性单位法(TU)以及混合毒性指数法(MTI)等分别评价了FQs和TCs对斑马鱼的联合毒性效应为竞争性抑制。FQs、TCs或DKAs暴露后,120 hpf幼鱼的自发行为活动能力或行为方式发生改变,可产生兴奋性、抑制性或倒“U”型运动效应。对外界刺激的反应能力降低、恢复能力或适应能力减弱,并具有一定的剂量-效应关系。DKAs暴露后,在心脏发育过程中没有明显的畸形的情况下,心率明显降低,如150 mg/L处理组比对照组降低了约20%。总而言之,DKAs对斑马鱼复合暴毒其毒性相当于或略小于TCs单独暴毒的毒性,在生态健康评估方面具有重要意义。 此外,对斑马鱼进行慢性复合暴毒,利用转录组学技术探讨其在分子水平上对斑马鱼的毒性效应。本实验测定了对照组、两个DKAs处理组3月龄斑马鱼的整体转录组,获得了不同长度的有效读长(valid reads)19.53万条,并完成了valid reads功能注释和代谢通路分类。根据基因功能注释以及代谢通路分析结果,从不同DKAs处理差异表达的基因中筛选出了部分行为及氧化代谢相关基因。 与此同时,该试验中还同时研究对2月龄斑马鱼用DKAs复合慢性暴毒,结合组织病理学及酶指标等毒性终点进行验证,探索β-双酮抗生素引发的毒理学效应发生机制。即:分别测定了不同DKAs处理组斑马鱼个体中肌酸激酶(CK)活性、血清肌酐(Cr)浓度、乙酰胆碱酯酶(AChE)活性、过氧化产物丙二醛(MDA)浓度,并对其变化规律进行了阐述;通过透射电镜观察斑马鱼骨骼肌和肝脏,结合组织病理学变化,验证其转录组数据;通过实施定量PCR验证相关基因的表达。 研究发现:(1)将斑马鱼分别暴露于45、60、90 mg/L DKAs中,在7d、14d和21d测量上述4种酶指标,其中肌酸激酶和乙酰胆碱酯酶在所有处理组中均显著高于对照组(7 d时肌酸激酶只有90 mg/L处理组明显高于对照组);然而,对于血清肌酐来说,除了7d各处理组与对照组无明显变化外,7d、14d时浓度均显著低于对照组;与对照组相比,各阶段90 mg/L处理组丙二醛浓度均明显偏高。 (2)斑马鱼DKAs暴毒可以对肝脏造成极为严重的不同程度的组织损伤,包括细胞核固缩、染色质凝集或边集、线粒体嵴横纹加深及分布散乱、内质网肿胀、核糖体脱落等损伤,与此同时,还能够在细胞质中观察到微泡性脂肪变性和吞噬小泡。骨骼肌透射电镜结果显示,处理组肌肉发现明显损伤,具体表现为:肌肉细胞肌原纤维萎缩、间隔增大,并且造成肌浆网水肿,更为严重的情况下会造成肌浆网扩张、部分肌浆网膜破裂等状况;线粒体内嵴肿胀,并伴随着细胞质中出现中毒坏死巢等现象。随着暴毒浓度的逐渐增加,以上相关实验反应症状越加明显。 (3)暴露于90mg/L DKAs时,心脏相关基因gle1b、myl7,骨骼肌相关基因CKma、acta1a表达量显著变化;肝脏代谢相关基因AHRRa在所有处理组中均上调,而CYP3A65则在60 mg/L处理组中明显下调。