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研究背景及目标：以动脉粥样硬化为基本组织病理改变的血管病变发生发展导致血管重塑和管腔狭窄过程中,血管稳态的破坏、损伤修复失衡是最基本的特征。血管平滑肌细胞通过干/祖细胞分化及本身表型转化参与血管损伤修复及病理性重塑。我们课题组既往研究已经发现microRNA-34a(miR-34a)可促进胚胎干细胞分化为血管平滑肌细胞,然而对miR-34a是否调控成熟血管平滑肌细胞功能和血管病理重塑仍然知之甚少。本研究希望阐述miR-34a对血管平滑肌细胞表型转化后增殖迁移功能以及血管损伤后新生内膜形成的作用,并鉴定miR-34a靶基因,阐明其作用机制。研究方法：本研究分离小鼠原代血管平滑肌细胞体外培养,利用体外平滑肌细胞表型转化模型,观察miR-34a表达变化,并过表达或抑制miR-34a,研究miR-34a对血管平滑肌细胞增殖、迁移能力的影响。其次,利用生物信息学分析、分子克隆等方法鉴定miR-34a的功能性靶基因。最后,建立小鼠股动脉导丝损伤内膜病理性增生模型,在损伤血管局部过表达miR-34a,研究miR-34a对血管损伤后内膜新生的作用。结果：原代血管平滑肌细胞经历血清饥饿,FBS、PDGF-BB、ox-LDL刺激后表型由“收缩型”向“增殖迁移型”转化,在此过程中miR-34a表达显著下降。功能研究中,细胞计数和BrdU实验发现过表达miR-34a抑制FBS、PDGF-BB诱导的平滑肌细胞增殖,划痕实验和Transwell实验则表明过表达miR-34a减弱平滑肌细胞迁移能力,反之抑制miR-34a表达可增加平滑肌细胞增殖、迁移能力。多个miRNA的生物信息学分析数据库和RNA结构分析软件预测Notchl是miR-34a的靶基因。平滑肌细胞中过表达miR-34a在mRNA和蛋白水平下调Notch1表达,而抑制miR-34a则Notchl表达升高。分子克隆和荧光素酶报告实验表明,miR-34a高表达能显著降低Notchl 3’UTR调控的荧光素酶活性,而对Notchl 3’UTR中miR-34a结合位点进行突变后,miR-34a对荧光素酶活性的抑制作用被消除。miR-34a和Notchl过表达质粒共转染,发现miR-34a抑制平滑肌细胞增殖、迁移,而同时高表达Notch1可消除miR-34a的作用。成功建立小鼠股动脉导丝损伤内膜增生模型,发现miR-34a在血管损伤后内膜增生过程中显著下降,损伤血管局部高表达miR-34a可明显减轻血管损伤后内膜新生。此外,miR-34a高表达减弱Notchl在血管中表达,减少血管新生内膜中PCNA阳性细胞比例,从体内实验层面验证了miR-34a下调Notchl抑制平滑肌细胞增殖。结论：本研究成功揭示了miR-34a在血管平滑肌细胞中的新功能。miR-34a抑制血管平滑肌细胞表型转化后的增殖及迁移能力。Notch1是miR-34a的功能性靶基因,miR-34a直接结合Notch1 mRNA的3’UTR,下调Notch1表达,并通过调控Notch1影响平滑肌细胞功能。在血管损伤内膜病理性增生过程中,miR-34a过表达显著减轻新生内膜。miR-34a可能是防治平滑肌细胞相关血管疾病的新靶点。