论文部分内容阅读
【目的】建立用荧光定量RT—PCR法检测肺癌组织中人类有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptide,OATP)B和D mRNA的表达,并用免疫组化及图像分析技术定量分析肺癌组织中蛋白表达水平,分析其mRNA及蛋白表达与病理分型等临床资料的关系。【方法】1.荧光定量PCR标准曲线的建立及优化:(1)组织总RNA提取:用Tiozol试剂分别提取不同病理分型肺癌组织和正常肺组织中的总RNA。(2)cDNA的合成:以所提取的组织的总RNA为原料进行逆转录反应,获得cDNA。(3)PCR反应及重组质粒的构建:以逆转录的cDNA为模板,进行普通PCR扩增。扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶回收法进行纯化。用PGEM-T Easy质粒载体连接PCR纯化产物,构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞,蓝白斑筛选重组质粒。(4)标准曲线的建立及优化:优化荧光定量PCR体系和条件,以重组质粒为标准品建立检测OATP mRNA的标准曲线,并以此对40例肺癌标本中OATP-B和OATP-D mRNA的含量进行测定。2.免疫组化:采用链霉亲和素—过氧化酶法(S—P法),DAB显色液显色,以抗OATP-B和抗OATP-D为一抗,PBS作为阴性对照,鉴定肺癌中OATP-B和OATP-D蛋白的表达。用IPP4.0图像分析软件对免疫组化结果进行分析。3.临床资料分析:结合临床资料,分析OATP-B和OATP-D的mRNA及蛋白表达与病理分型、性别、年龄、肿瘤大小以及有无淋巴结转移等的关系。4.统计学分析:采用SPSS11.5统计学软件包对所得实验数据进行统计学分析,实验数据均用(?)±S表示,多组均数间的比较采用方差分析,多组均数间的两两比较采用q检验。P＜0.05,差异有统计学意义。【结果】构建了OATP基因的重组质粒,并且成功转化大肠杆菌JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选提取重组质粒,对质粒进行梯度稀释,以稀释的质粒为模板优化荧光定量PCR体系和条件,建立定量检测OATP-B和OATP-D mRNA的最佳荧光定量PCR体系。荧光定量PCR结果显示,OATP-B和OATP-D的mRNA在不同病理分型肺癌中表达上调,P＜0.05,差异有统计学意义;OATP-B和OATP-D的mRNA在有无淋巴结转移肺癌中的表达差异有统计学意义,P＜0.05。免疫组化法显示,与正常肺组织相比,OATP-B和OATP-D蛋白在不同病理分型肺癌中高表达,P＜0.05,差异有统计学意义;OATP-B和OATP-D蛋白在有淋巴结转移肺癌中的表达明显无高于淋巴结转移肺癌,P＜0.05,差异有统计学意义。OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白在不同病理分型、性别、年龄及不同大小肺癌标本间的表达无统计学差异,P＞0.05。【结论】1.建立并优化检测OATP-B和OATP-DmRNA表达的荧光定量PCR体系。2.OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白在不同病理分型肺癌及淋巴结转移肺癌中均高表达;OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白的表达与肺癌标本的不同病理分型、性别、年龄及大小无关。提示OATP-B和OATP-D在肺癌的发生、发展中发挥了重要作用,一方面可能为肿瘤发生及药物治疗的分子机制提出新的理论,另一方面为其他肿瘤多种基因的大规模临床检测提供了迅速可靠的mRNA荧光定量方法。