论文部分内容阅读
L-茶氨酸是一种存在于茶叶中的游离氨基酸,具有降血压、抗肿瘤和保护神经等多种生理功能,在食品与保健品领域有着广泛的应用。Y-谷氨酰基转移酶(γ-glutamyltranspeptidase, GGT, EC 2.3.2.2)能够催化谷氨酰胺与乙胺反应生成L-茶氨酸,且反应过程不需要ATP的参与,因此利用GGT来催化合成L-茶氨酸成为了目前研究的热点。本研究首先利用大肠杆菌表达来源于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的Y-谷氨酰基转移酶,随后将其用于L-茶氨酸的酶法合成并对催化条件进行优化,最后利用阳离子交换层析法分离纯化L-茶氨酸。本文的主要研究内容如下：首先,构建了含有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌GGT基因的重组质粒pET28a-EGGT和pET28a-BGGT。将其转化到E. coli BL21 (DE3)中,并对重组菌的培养条件表达条件进行优化,通过亲和层析分别纯化获得重组EGGT和BGGT蛋白,并对其酶学性质进行表征。其次,分析了GGT催化L-茶氨酸合成反应中的副产物,明确了反应中存在着以下三种副反应：(a)L-谷氨酰胺不可逆的降解为L-焦谷氨酸；(b)GGT催化L-谷氨酰胺的自转肽反应生成γ-谷氨酰基-谷氨酰胺(y-glu-gln); (c) L-茶氨酸的自转肽反应生成γ-谷氨酰基-茶氨酸。优化了大肠杆菌来源的GGT催化L-茶氨酸合成的反应条件,得到最优的反应条件为：在10 mLNa2CO3-NaHCO3缓冲液(100 mM, pH10.0)中,添加300 mM L-谷氨酰胺和1.8 M乙胺盐酸盐,加入重组菌菌体15mg/mL,在30-C下反应12 h,L-茶氨酸的最高合成量可达28.2 g/L,L-茶氨酸对L-谷氨酰胺的转化率为55.20%。再次,优化了B. subtilis来源的GGT催化L-茶氨酸合成的反应条件：以300mM谷氨酰胺和3 M乙胺盐酸盐为底物,以100 mM Na2CO3-NaHCO3为缓冲液(pH 10.5),加入湿菌体30 mg/mL,于30℃下反应6 h,L-茶氨酸的产量为34.65g/L,L-茶氨酸对L-谷氨酰胺的转化率为64.88%。为提高L-茶氨酸产量,考察了不同分批补料方式对L-茶氨酸合成的影响。选择以100 mM L-谷氨酰胺为初始浓度,当L-谷氨酰胺不足20 mM时,补加100 mM L-谷氨酰胺的方式,经过四次补加,L-茶氨酸可达63.20g/L。最后,利用离子交换树脂纯化L-茶氨酸,选择HZ016阳离子树脂为交换介质,建立了从酶促反应液中纯化L-茶氨酸的方法,L-茶氨酸的纯度为94.6%,L-茶氨酸的总回收率达到40.4%。