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目的:在青光眼患者中,病理性眼压升高会导致视神经病变并伴特征性视野缺损,其发病原因主要是由于房水排出通道发生病变,部位在小梁网。大量研究表明:细胞外基质（Extracelluar matrix,ECM）异常沉积是导致小梁网处房水流出增加进而导致病理性眼压增高的主要原因。氧化应激是细胞内氧自由基相对超负荷引起的细胞应激反应,是青光眼的可能发病机制之一,并在小梁网细胞（Human Trabecular Meshwork Cells,HTMCs）损害中发挥作用。对青光眼患者小梁网的形态学和生化方面的分析显示,氧化应激可以导致ECM沉积、细胞骨架改变、细胞衰老死亡和大量炎症因子产生。Hairy and enhancer of split-1（HES1）是一类碱性-螺旋-环-螺旋转录因子,也是Notch信号通路发挥作用的主要靶基因之一。研究表明,HES1在Notch信号通路介导的纤维化疾病过程高表达,提示HES1可能参与促纤维化ECM蛋白的异常沉积过程。因此本实验主要探究,氧化应激状态下,HES1对HTMCs的ECM生成的调控作用,及对相应细胞增殖和迁移能力的影响。方法:1)通过CCK-8法分析0μM,100μM,200μM,300μM,400μM,600μM,800μM,1000μM H2O2对HTMCs细胞活性影响。同时H2O2分别刺激2 h、4h、8 h和12 h,Western blot检测ECM蛋白（Fibronectin、FN,Collagen、COL1,Laminin、LN）表达,从而确定H2O2最终使用浓度和刺激时间,作为氧化应激模型的诱导条件。2)300μM H2O2刺激HTMCs 2 h诱导氧化应激反应后,Western blot和免疫荧光法检测HTMCs氧化应激模型中促纤维化ECM蛋白（FN、COL1、LN和α-SMA）表达变化。CCK-8分析法检测HTMCs增殖活性,Transwell迁移实验检测H2O2刺激后HTMCs迁移细胞数。Real-time PCR和Western blot法检测HES1基因蛋白水平表达。3)应用RNAi技术构建HES1 shRNA慢病毒质粒,应用Lipofectamine2000脂质体慢病毒包装法包装HES1 shRNA病毒并感染HTMCs,使HTMCs稳定表达HES1shRNA。Real-time PCR和Western blot检测HES1基因蛋白表达水平,评估HES1 shRNA敲低效果。HES1表达下调对促纤维化ECM的影响主要通过Western blot和Real-time PCR/免疫荧光法评估。HTMCs的增殖活性和迁移能力分别用CCK-8法和Transwell计数实验进行检测分析。4)以Addgene上购买的HES1质粒为模板,应用慢病毒载体,构建HES1过表达质粒,并包装相应HES1 p.cDNA病毒,以此来感染HTMCs建立大量稳定表达HES1的细胞系。Real-time PCR和Western blot检测HES1基因蛋白表达水平评估HES1 p.cDNA感染的效果。而分析HES1 p.cDNA慢病毒对ECM蛋白表达的影响则用Western blot、Real-timePCR和免疫荧光。Transwell和CCK-8分析法分别评估HTMCs的迁移和增殖能力。结果:1)通过7种不同浓度（0μM,100μM,200μM,300μM,400μM,600μM,800μM,1000μM）H2O2刺激HTMCs 2 h,结果发现:与无血清组相比,低浓度H2O2（100μM、200μM、300μM、400μM）对细胞活性影响相对较小,而高浓度H2O2（600μM、800μM、1000μM）刺激条件下细胞活性明显受到抑制。不同时间,HTMCs中ECM蛋白表达变化不同,其中以刺激2 h ECM蛋白变化最为显著。2)300μM H2O2刺激2 h诱导HTMCs氧化应激反应中,ECM蛋白（FN、COL1和LN）和α-SMA蛋白表达水平显著增高,而H2O2对HTMCs增殖具有抑制作用,并减弱相应的迁移能力。同时H2O2刺激条件下,在HTMCs中,HES1基因和蛋白水平表达明显上调,以300μM H2O2刺激最为显著。3)原代HTMCs感染HES1shRNA/Scramble慢病毒后,HES1基因和蛋白表达均下调。而在H2O2刺激条件下,HES1shRNA/Scramble稳定转染后,HTMCs的HES1和ECM蛋白表达明显上调,与Scramble shRNA相比,HES1 shRNA可以有效抑制H2O2诱导的促纤维化ECM高表达。同时,感染HES1 shRNA病毒后,氧化应激状态下的HTMCs增殖能力明显有所改善,缓解H2O2对HTMCs迁移能力的抑制作用。而正常HTMCs感染HES1shRNA/Scramble慢病毒后,ECM蛋白表达及细胞功能表现出与氧化应激状态下类似改变。4)过表达HES1后,HTMCs中HES1基因和蛋白表达水平显著上调,其中以蛋白水平最为明显。同时,qPCR、Western blot及免疫荧光结果显示HTMCs促纤维化ECM蛋白表达增多。对细胞功能研究则发现,HTMCs在24 h和48 h时增殖能力减弱,而迁移能力也受到抑制,Transwell实验检测HES1 p.cDNA组细胞迁移数量少于对照组。进一步说明了HES1在HTMCs中参与ECM异常沉积的过程。结论:1.300μM H2O2刺激2 h可以有效诱导的HTMCs氧化应激反应。2.氧化应激可促进HTMCs中ECM分泌增加,可能与HES1表达上调有一定关系。3.HES1基因高表达是引起HTMCs中ECM蛋白产生增多的一个重要因素,因此HES1可能会为研究青光眼的发病机制提供新思路。