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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种仔猪急性肠道传染病,该病给全球养猪业造成了巨大的经济损失,成为当前共同关注的猪病问题。适时掌握PEDV流行毒株的分子特征并进行快速诊断防控对该病具有重要意义。本研究开展了PEDV ORF3基因的克隆与变异分析,再以此为基础建立了可快速检测PEDV的Eva Green荧光定量RT-PCR方法,为PED的诊断提供新的技术支持。1 PEDVORF3基因的变异分析根据GenBank中PEDV CV777株ORF3基因序列,设计特异性引物,用RT-PCR扩增了2014-2015年四川、重庆、福建、黑龙江等地共21个代表性的ORF3基因,并构建重组质粒,进行了基因测序和变异分析。结果显示,21个ORF3基因全长675 bp,编码224个氨基酸。ORF3基因没有碱基缺失,只有碱基突变,而且多以C→T、T→C、G→A、A→T等突变形式存在,氨基酸突变多以Val→Ala、Phe→Val、Ala→Thr、Asn→Ser等突变形式存在。21个ORF3序列的核苷酸和氨基酸序列相似性为分别98.1%～100%和96.4%～100%；而与CV777标准株相比,核酸序列相似性在95.9%～99.6%,氨基酸序列相似性在94.2%～99.6%。经过遗传进化分析,绘制系统发育树后21个ORF3序列和参考序列可分成三个组,即G1、G2和G3。我国的21个PEDV属于G3组,与韩国株（2008-2012）、美国株（2014）、德国株（2014）以及部分前期中国株（2012-2014）位于同一分支,但与G1群的英国株（Brl/87）和标准株（CV777）等、G2群的DR13弱毒株亲缘关系较远。2 Eva Green荧光定量RT-PCR检测PEDV方法的研究根据GenBank中PEDV CV777株及Attenuated DR13株ORF3基因序列,设计一对特异性引物,以野毒和疫苗毒的cDNA为模板,采用RT-PCR扩增并构建了2个重组质粒,经核酸蛋白仪测定OD280和OD260值后,计算得到的拷贝数分别是4.79×1011copies/μL和5.17×1011copies/μL。在优化条件（引物浓度和退火温度）后,野毒和疫苗质粒浓度分别为4.79×103copies/μL～4.79×108 copies/μL和5.17×103 copies/μL～5.17×108 copies/μL时,绘制标准曲线及熔解曲线,构建Eva Green荧光定量RT-PCR检测方法（Eva Green real time quantitative PCR,简称EG-qRT-PCR）。通过检测PEDV、TGEV、JEV、PoRV、PRRSV、 PCV、PRV和PPV,只有PEDV有扩增峰,证明特异性良好；EG-qRT-PCR及RT-PCR可检测的最低浓度分别为100 copies/μL、103 copies/μL;强（弱）毒的组内和组间重复试验显示,变异系数都小于0.56%（0.82%）和1.05%（1.02%）,重复性良好。用该方法检测了2014-2016四川地区共130份仔猪腹泻病料,EG-qRT-PCR和RT-PCR阳性检出率分别为72.31%（94/130）、58.46%（76/130），阳性样品的PEDV浓度为5.13×105 copies/μL～6.31×1010 copies/μL。用该方法初步测定了我国市售PEDV疫苗含量,结果显示弱毒活疫苗PEDV含量可以达到2.49×108 copies/μL,但是灭活疫苗中PEDV检出含量较低,最高只有5.80×102 copies/μL。以EG-qRT-PCR测定了临床发病猪的心、肝、脾、肺、肾、肠淋巴结和肠组织的PEDV含量后,病毒检出浓度分别为3.09×105～4.47×108 copies/μL,8.91×104～1.38×108 copies/μL,0～6.61×105 copies/μL,0～3.16×106 copies/μL,4.79×105～6.31×108 copies/μL,1.12×107～9.12×109 copies/μL,3.55×109～3.16×1012 copies/μL,其中肠组织PEDV含量最多,其次为肠淋巴结；在这些组织中脾肺组织的检出率最低,偶尔可以检测到。