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NS3/4A蛋白酶在HCV感染、致病过程中具有不可替代的作用,是抗HCV药物研发的重要靶点。目前以NS3/4A蛋白酶为靶点的上市药物特拉匹韦、博赛匹韦、西米普韦等必须与PEG-IFNα/RBV联用,且存在易耐药、毒副作用强、生物利用度低等缺点。因此开发耐药屏障高、生物利用度高、可单独使用的NS3/4A蛋白酶抑制剂依然具有重要意义。为解决筛选中的假阳性问题,本文首先构建了以重组EGFP为底物的筛选模型。将NS3/4A识别的NS5A/B序列插入到EGFP的173位氨基酸后成为重组EGFP/5AB蛋白。EGFP/5AB荧光信号的强度与NS3/4A蛋白酶的量呈反比,与其抑制剂的强弱呈正比,因此利用酶标仪检测即可实现抑制剂的筛选。本文以香榧树作为研究对象,从8.7 kg香榧树枝叶中分别获得乙醇浸膏575 g,石油醚萃取物104 g,乙酸乙酯萃取物66 g,正丁醇萃取物160 g,进而分离得到22个化合物,其中明确结构的化合物16个,新化合物1个。利用NS3/4A蛋白酶筛选模型对上述22个化合物进行了筛选,发现YZ-2-5-2、YZ-3-1、YZ-3-2具有NS3/4A蛋白酶抑制活性。化合物YZ-2-5-2的分子量为342,分子式为C16H22O8,最终鉴定为β-D-Glucopyranoside,3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propen-1-yl,IC50为3.2 mM。YZ-3-1分子量为208,分子式为C11H14O3,最终鉴定为2-methoxy-4-(3-methoxyprop-1-en-1-yl)phenol,IC50为2.7 m M。YZ-3-2分子量为194,分子式为C10H12O3,最终鉴定为4-(3-hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol。经化合物的生物活性初步评价,发现YZ-3-2的NS3/4A蛋白酶抑制活性较高,IC50为1 mM,而阳性对照VX950(特拉匹韦)的IC50为0.2 mM。总之,本文获得的3个化合物的IC50与阳性对照VX950虽有较大差距,但有希望作为NS3/4A蛋白酶抑制剂的先导化合物进行开发。