“应用天然或人工合成的化合物去阻断、逆转或预防侵袭性肿瘤的发生”,即肿瘤的化学预防(Chemoprevention)。国际癌症中心曾指出,在复杂多样的致癌因素中,80%～90%的人类肿瘤是由化学致癌物引起的。化学致癌物可损伤细胞DNA,使基因发生突变,从而引起肿瘤。肿瘤预防研究的目的之一就是寻找高效、低毒的药物。由于化学药品的毒副作用以及人们认识到“回归大自然”的重要性,天然药物在肿瘤预防中所起到的作用,日益受到重视。我国有着宝贵、丰富的中药资源,如何高通量地从中药中筛选出预防肿瘤的有效成分,已成为一个迫切需要解决的瓶颈问题。目前,国内外应用于药物筛选的模型大致分为三类:整体动物水平模型、组织器官水平模型和细胞分子水平模型。前两种模型往往消耗样品量大,要使用大量的实验动物,劳动强度高,耗时耗力,并且一次试验筛选样品量有限,不适合成分复杂的中药有效活性成分的筛选。细胞分子水平的药物筛选模型具有材料用量少、省时高效、药物作用机制比较明确、可实现大规模的筛选等特点,但在分子和细胞水平上对化学预防剂的有效鉴别的研究还相当缺乏,通过建立转基因细胞模型对预防肿瘤中药进行高通量筛选的研究,国内外均未见报道。本研究旨在建立一种简便易行、高度敏感和高效率的筛选肿瘤预防药物的细胞模型,并用于从现有中药中筛选预防肿瘤的有效成分。1.应用重组PCR技术,以质粒pRL-TK为模板,获得重组TK启动子,并在其基本启动子上游引入Sac I酶切位点。将TK启动子片段克隆入pMD18-T载体中,构建载体pMD-TK。用Sal I和BamH I对质粒pMD-TK和pEGFP进行双酶切,将TK启动子连接到载体pEGFP中构建载体pTK-GFP。再以质粒pTK-GFP为模板扩增TK目的片段,用Vsp I和BamH I对扩增出的TK目的片段和载体pEGFP-N1进行酶切,将TK启动子连接到载体pEGFP-N1上,构建真核报告载体pTK-GFP/neo。人工合成的4个ARE序列,经退火磷酸化后逐个连接到载体pTK-GFP/neo上。首次在国内分别构建了真核报告载体pARE-TK- GFP/neo、p2ARE-TK-GFP/neo、p3ARE-TK-GFP/neo和p4ARE-TK-GFP/neo。2.真核报告载体pTK-GFP/neo、pARE-TK-GFP/neo、p2ARE-TK-GFP/neo和p4ARE-TK-GFP/neo用脂质体转染HepG2细胞,24 h后在荧光显微镜下观察到4种细胞都发出绿色荧光,说明启动子的选择是较为合适的。接着用600μg/mL G418筛选出阳性细胞克隆。首次在国内构建了无ARE调控的细胞模型HepG2-TK-GFP和不同ARE重复序列调控的细胞模型HepG2-ARE-TK-GFP、HepG2-2ARE-TK-GFP、HepG2-3ARE-TK-GFP和HepG2-4ARE-TK-GFP。3. HepG2-TK-GFP、HepG2-ARE-TK-GFP、HepG2-2ARE-TK-GFP和HepG2- 4ARE-TK-GFP细胞扩增后,经胰酶消化,接种入黑色96孔细胞培养板,每孔细胞数为5×104个,培养24 h后,除对照孔外,各孔加入终浓度为100μM的tBHQ,并设5个重复。24小时后用PBS洗涤,再加入100μg/mL EB 200μL室温下染色20 min,再用PBS洗涤1次后加入200μL PBS,用多功能荧光酶标仪检测细胞的GFP和EB荧光强度,求其相对发光度。结果HepG2-4ARE-TK-GFP细胞的GFP诱导表达水平最高,为HepG2-TK-GFP细胞的6倍,选用该细胞中对GFP具有最高表达水平和最低基础水平的克隆做后续实验。4.将HepG2-TK-GFP和HepG2-4ARE-TK-GFP细胞扩增后,接种入黑色96孔细胞培养板,培养24 h后加入不同浓度(0(DMSO对照)、12.5、25、50、100、200μM)的阳性受试物PDTC和tBHQ。每浓度设5个重复,作用24 h后用PBS洗涤,加入EB染色,用多功能荧光酶标仪检测细胞的GFP和EB荧光强度。结果显示PDTC和tBHQ对HepG2-TK-GFP细胞的GFP荧光均无诱导作用,其荧光强度呈不规则变化,各浓度组之间差异不显著(P>0.05);PDTC诱导的HepG2-4ARE-TK-GFP细胞中的GFP荧光随着PDTC浓度的升高,荧光表达水平呈先上升后下降的趋势,具有一定的剂量效应关系。在浓度为50μM时诱导效果最好,与对照组比较差异有显著性(P<0.05);tBHQ诱导的HepG2-4ARE-TK-GFP细胞中的GFP荧光随着tBHQ浓度的升高,荧光表达水平持续上升,各组(12.5, 25, 50, 100, 200μM)与对照组比较差异都有显著性(P<0.05),且具有一定的剂量效应关系。从而证实本实验所构建的这种转基因细胞模型可用来筛选不同结构性质的化学预防剂。5.以质粒pDsRed2-N1为模板扩增红色荧光蛋白及启动子片段克隆入载体pMD18-T上,构建载体pMD-DsRed。用Ade I和BspT I对载体pMD-DsRed和p4ARE-TK-GFP/neo进行双酶切,将目的红色荧光蛋白及启动子片段连接到载体p4ARE-TK-GFP/neo上,构建真核报告载体p4ARE-TK-GFP/DsRed/ neo。该载体用脂质体转染HepG2细胞,并用G418筛选出阳性细胞克隆。首次构建了以GFP为第一信号,以红色荧光蛋白为第二信号的细胞模型HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed。将该细胞接种入黑色96孔培养板,培养24 h后加入不同浓度(0(DMSO对照)、12.5、25、50、100、200μM)的阳性受试物PDTC和tBHQ。所得结果与HepG2-4ARE-TK-GFP细胞模型中的结果基本一致,证实对转基因细胞模型HepG2-4ARE-TK-GFP的完善是成功的,使筛选更简单、更方便、更准确。6.首次利用HepG2-4ARE-TK-GFP细胞模型对22种中药单体、3种中药有效部位、复方六味地黄胶囊、四君子汤以及组成两方的各单味中药的提取物进行了筛选,结果中药单体中穿心莲内酯、黄芩苷、大黄酸、大黄素、槲皮素、大豆苷元、熊果酸、白藜芦醇显示结果为阳性,且都具有一定的剂量效应关系,提示8种单体能诱导Ⅱ相酶表达起到化学预防作用;三种有效部位中半枝莲总黄酮注射液和黄芪注射液显示结果为阳性,提示其阻断癌前病变和抗突变的作用可能是通过诱导Ⅱ相酶表达实现的;复方六味地黄胶囊和四君子汤的显示结果为阳性,单味中药提取物中熟地黄、人参、白术显示结果为阳性。其中复方六味地黄胶囊效果优于该方中的单味中药熟地黄,提示其诱导效果可能是因为复方产生了新的成分或是各成分的联合诱导了该模型中GFP的表达。