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目的:通过观察慢性阻塞性肺疾病伴气道高反应性(COPD伴AHR)大鼠模型相关的激素和若干炎性因子的变化,来研究慢性阻塞性肺疾病伴气道高反应性大鼠模型下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis,HPA轴)和若干细胞因子的变化规律;并与COPD大鼠模型进行对比研究。同时从大鼠模型的症状、病理学改变、肺功能改变、HPA轴的变化、炎性细胞因子的变化等,观察补肾益气中药对它们的调节作用。方法:实验分为两部分:第一部分:模型组的制作1.1造模与分组:健康清洁级雄性挪威大鼠(Brown Norway,BN)120只,体重180~220g。分为四组,每组12只。A组:COPD伴AHR模型组:以卵蛋白致敏、激发、气管内滴注内毒素(LPS)及熏烟BN大鼠制作COPD伴AHR模型。B组:哮喘反复发作模型组:第一天用100mg卵蛋白加氢氧化铝凝胶1ml的混悬液进行致敏,第14天用浓度为5%的卵蛋白生理盐水溶液进行雾化激发,每天1次,连续7天,停止激发7天之后,再激发7天。C组:正常对照组:不做任何处理。D组:COPD模型组用气管内滴注内毒素(LPS)及熏烟BN大鼠制作COPD模型。1.2标本采集与检测:所有大鼠均在上午8∶30~10∶30麻醉,其中,A组与B组在最后一次用卵蛋白激发后半小时内麻醉,先测所有大鼠肺功能(FEV1、FVC)、气道阻力等,并取下丘脑、心脏血、肺泡灌洗液、肺组织等标本。用Realtime-PCR方法检测下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)mRNA的表达;放射免疫法检测血浆中促肾上腺皮质激素(ACTH)的浓度;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清和灌洗液中的IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α和血清皮质酮(CORT)。第二部分:用药组模型制作2.1造模与分组:造模方法同第一部分的A组与D组。按照复方不同剂量分为六组,每组12只。E组:COPD低剂量用药组F组:COPD中剂量用药组G组:COPD高剂量用药组H组:COPD伴AHR低剂量用药组L组:COPD伴AHR中剂量用药组M组:COPD伴AHR高剂量用药组E、F、G用药组在造模第8天开始灌胃,每只2ml,用不同剂量补肾益气中药连续灌胃21天,第29天先测大鼠肺功能(FEV1、FVC)、气道阻力等,然后取各组大鼠的肺组织、心脏血、肺泡灌洗液、下丘脑组织,检测方法同前。H、L、M用药组在开始熏烟后第八天开始灌胃,每只2ml,用不同剂量补肾益气中药连续灌胃21天,最后一天先用卵蛋白激发,再测(FEV1、FVC)、气道阻力,检测方法与第一部分相同。结果:第一部分:模型组与正常对照组的变化规律1.HPA轴变化:1.1下丘脑CRHmRNA:经对数转换,4组下丘脑CRHmRNA比较,差别无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,哮喘反复发作组与COPD组比较有统计学意义(P<0.05),COPD组与正常组比较有显著性差异(P<0.01)。COPD模型组与COPD伴AHR模型组中,CRHmRNA值均有下降,其中COPD伴AHR模型组中,下降得最明显。1.2血浆ACTH:经对数转换,4组血浆ACTH比较,无统计学意义(P>0.05)。1.3血清CORT值:4组血清CORT值比较,有统计学意义(P<0.05)。其中COPD伴AHR模型组与COPD模型组的血清CORT值均降低。2.细胞因子的变化:2.1血清IL-4:4组血清IL-4比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,COPD伴AHR组与COPD组比较,有统计学意义(P<0.05)。血清IL-4在哮喘反复发作组中升高明显。灌洗液IL-4:4组灌洗液IL-4比较,无统计学意义(P>0.05)。在COPD模型组中,IL-4有升高。2.2血清IL-5:4组血清IL-5比较,有显著性差异(P<0.01),呈上升趋势。其中两两比较,哮喘组与COPD组比较有显著性差异(P<0.01)亦即在COPD组中所测的血清IL-5明显高于哮喘组;COPD组与正常组比较有统计学意义(P<0.05)。灌洗液IL-5:4组灌洗液IL-5比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,COPD伴AHR组与哮喘组比较,高于哮喘组,有显著性差异(P<0.01)。2.3血清IL-6:4组血清IL-6比较,有统计学意义(P<0.01)。血清IL-6值在哮喘反复发作组中最高。灌洗液IL-6:4组灌洗液IL-6比较,IL-6值呈上升趋势,有显著性差异(P<0.01)。其中两两比较,COPD伴AHR组与COPD组比较有显著性差异(P<0.01);哮喘组与COPD组比较,有统计学意义(P<0.05)。灌洗液IL-6值在COPD模型组中升高。2.4血清IL-8:4组血清IL-8比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,哮喘组与正常组比较有统计学差异(P<0.05);哮喘组与COPD组比较有统计学意义(P<0.05);哮喘组的血清IL—8值高于正常组和COPD组。灌洗液IL-8:4组灌洗液IL-8比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,COPD伴AHR组与哮喘组比较有显著性差异(P<0.01);哮喘组与COPD组比较有显著性差异(P<0.01)。2.5血清TNF-α:4组血清TNF-α比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,COPD伴AHR组与哮喘组比较有显著性差异(P<0.01);哮喘组中的值高于COPD伴AHR组中的值。灌洗液TNF-α:4组灌洗液TNF-α比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,COPD组与正常对照组比较差别有显著性(P<0.01)。2.6血清IFN-γ:4组血清IFN-γ比较,无统计学意义(P>0.05)。灌洗液IFN-γ:4组灌洗液IFN-γ比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,哮喘组与正常对照组比较有显著性差别(P<0.01);COPD组与正常对照组比较有统计学差异(P<0.05)。3.肺功能的变化正常组的肺功能最佳,哮喘反复发作组、COPD模型组、COPD伴AHR模型组的大鼠肺功能减弱,4组组间比较,FEV1有统计学意义P<0.05。FVC没有统计学意义,P>0.05。其中哮喘反复发作组与正常组比较,P<0.05第二部分1.用药组HPA轴变化规律:1.1下丘脑CRHmRNA:COPD低、中、高剂量用药组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01);且COPD低、中、高剂量用药组之间比较,有统计学意义(P<0.05);低剂量组时上升明显,高剂量时反而呈下降的趋势。COPD低、中、高剂量用药组与COPD模型组比较,有统计学意义(P<0.05)。COPD伴AHR低、中、高剂量用药组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01)随着用药剂量的增加,CRHmRNA先呈下降的趋势,然后再呈上升的趋势。但较正常组均有上升的趋势。其中两两比较,COPD低剂量组与COPD模型组比较有统计学意义(P<0.05);COPD低剂量组与COPD高剂量组比较有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR模型组与COPD伴AHR低剂量组比较有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR模型组与中剂量和高剂量组比较均有显著性差异(P<0.01)。1.2血浆ACTH:经对数转换,COPD低、中、高剂量组与正常对照组、COPD模型组比较,没有统计学意义(P>0.05);COPD伴AHR低、中、高剂量组与正常对照组、COPD伴AHR模型组比较,有统计学意义(P<0.05),随着剂量的增加,呈下降的趋势。1.3血清CORT:COPD低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD中、高剂量组比较,有显著性差异(P<0.01),中剂量组时血清CORT含量较高;COPD伴AHR低、中、高剂量组比较有显著性差异(P<0.01)随着剂量增加,CORT值呈升高的趋势;COPD伴AHR低剂量组与中剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低剂量组与高剂量组比较,差别有显著性(P<0.01);COPD伴AHR中剂量组与高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR模型组与中剂量组比较,差别有显著性(P<0.01);2.用药组细胞因子的变化:2.1血清IL-4:COPD低、中、高剂量组与正常组、COPD模型组比较,有统计学意义(P<0.05)。随着剂量的增加,血清IL-4值略呈下降的趋势。COPD伴AHR低、中、高剂量组与正常组、COPD伴AHR模型组比较,有显著性差异(P<0.01)。用药组中的血清IL-4值比正常值和模型组中的IL-4值低。灌洗液IL-4:COPD低、中剂量组比较,有显著性差别(P<0.01);COPD低、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05)。2.2血清IL-5:COPD伴AHR高剂量组与正常对照组比较,有显著性差别(P<0.01)。灌洗液IL-5:COPD低、中剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD低、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD高剂量组与正常对照组比较,有统计学意义(P<0.05)。2.3血清IL-6:COPD低、中、高剂量组比较,有显著性差别(P<0.01),随着剂量的增加,IL-6呈下降的趋势;COPD低、中、高剂量组与COPD模型组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD低、中剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD低、高剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD中、高剂量组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD伴AHR高剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01)。灌洗液IL-6:COPD伴AHR低、中、高剂量组比较,有统计学差异(P<0.05);中剂量组时,IL-6值降到最低点。COPD伴AHR低、中剂量组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD伴AHR低、高剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR中剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR高剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01);2.4血清IL-8:COPD低剂量组与COPD模型组比较有显著性差异(P<0.05);COPD高剂量组与COPD模型组比较有显著性差异(P<0.05)。灌洗液IL-8:COPD低、中、高剂量组与COPD模型组比较,有统计学差异(P<0.05);高剂量组时IL-8下降得最多。COPD低剂量组与COPD高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低、中、高剂量组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD伴AHR低剂量组与中剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR中剂量组与高剂量组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD低、中、高剂量组分别与正常对照组比较,差别均有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01)。2.5血清TNF-α:正常对照组、COPD模型组、COPD低、中、高剂量用药组比较,差别有统计学意义(P<0.05);高剂量组时,血清TNF-α值最低。COPD低、中、高剂量用药组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD低剂量组与高剂量用药组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD模型组与COPD高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05)。灌洗液TNF-α:COPD低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);中剂量组时,TNF-α值降得最低。COPD伴AHR低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05),随着剂量的增加,TNF-α值呈下降的趋势。2.6血清IFN-γ:COPD低、中、高剂量组、正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01);随着剂量的增加,血清IFN-γ值呈下降的趋势。COPD低、中、高剂量组三组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD低剂量组与高剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR模型组、COPD伴AHR低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低、中、高剂量组分别与COPD伴AHR模型组两两比较,有统计学意义(P<0.05)。灌洗液IFN-γ:COPD低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD低、中、高剂量组、COPD模型组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD低、中剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低剂量组与高剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR中剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01):COPD伴AHR高剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR低剂量组与COPD伴AHR模型组比较,差别有显著性(P<0.01):COPD伴AHR中剂量组与COPD伴AHR模型组比较,有显著性意义(P<0.01);3.用药组肺功能的变化COPD低、中、高剂量组随着补肾益气中药剂量的增加,各组的FEV1与FVC变化不明显,说明补肾益气中药对COPD模型的肺功能改善作用不大。,COPD伴AHR低、中、高剂量组随着用药剂量的增加,肺功能的指标FEV1与FVC相应的增大,且高剂量组中最为明显,与低剂量组比较,有统计学意义。说明了COPD伴AHR模型组是存在气道阻塞部分可逆的情况,通过用药改善了它的肺功能。结论:1、COPD伴AHR大鼠模型HPA轴功能低下与紊乱;2、IL-8、TNF-α是参与COPD气道炎症过程的重要的细胞因子。IL-6可能参与了COPD的气道炎症过程。在本实验中,在COPD伴AHR模型中,IL-8和TNF-α升高明显,推测它们参与了COPD伴AHR的气道炎症过程。其中,IL-8在哮喘反复发作中也起了一定的作用。3、在COPD伴AHR模型组中,血清和灌洗液的IL-4值均有升高,而IFN-γ下降明显,推测IL-4/IFN-γ平衡可能在COPD伴AHR发病中起到一定的作用。4、由仙灵脾与黄芪组成的补肾益气方可以改善HPA轴功能,调节机体免疫。同时能够改善COPD伴AHR大鼠模型的肺功能。5、可能参与COPD、COPD伴AHR、哮喘的相关细胞因子,见表16、COPD和COPD伴AHR的HPA轴相关指标的变化及补肾益气药的调节作用,见表2。