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脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的发病率逐年增高,并且危害性大、神经功能恢复差,已然成为当前重要的医学难题及社会公共问题。目前,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植已发展成为人们探索治疗脊髓损伤的新途径。然而单纯应用神经干细胞移植对SCI的修复作用并不理想,主要原因在于神经干细胞难以向功能性神经元分化而多分化为神经胶质细胞。神经营养因子3(neurotrophin-3,NT-3)作为一种神经营养因子,与其特异性酪氨酸激酶受体C(tyrosine kinase receptor C,TrkC)结合后通过激活相关信号蛋白分子能够对神经细胞的存活、增殖及分化起到重要的调控作用。另外,转录因子Sox2[SRY(sex determining region Y)-box 2],不仅具有干性维持作用,其在神经细胞分化中的作用也受到越来越多的关注。本研究通过系列实验证实外源性的NT-3能够上调神经干细胞中Sox2的表达,后者进而诱导神经干细胞向神经元方向的分化,此过程是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。其中,上调后的Sox2可能通过调控TrkC基因的转录而调节其蛋白的表达,进而影响神经干细胞向神经元方向的分化。材料与方法1.原代大鼠神经干细胞的分离培养及鉴定神经干细胞来源于孕14~15天(d)Sprague-Dawley(SD)胎鼠的大脑皮层组织,参照Pluchino法进行原代培养。首先,为了检测神经干细胞标志物巢蛋白(Nestin)及干性转录因子Sox2的表达,将神经干细胞球接种于预先使用多聚鸟氨酸(Poly-L-ornithine,P-L-O)包被过的激光共聚焦培养皿中,培养24小时(h)后进行Nestin及Sox2的免疫荧光(immunofluorescence,IF)染色鉴定。另外,为进一步证实所培养细胞具有多向分化潜能,将使用分化培养基[用1%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)代替生长因子]培养48 h后的细胞进行神经元前体细胞标志物(Doublecortin,DCX)、少突胶质细胞标志物2(oligodendrocytes marker2,Olig2)及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的IF染色鉴定。2.NT-3对NSCs中Sox2蛋白表达量的影响为了检测外源性的NT-3对NSCs中Sox2蛋白表达量的影响,我们将原代培养的神经干细胞随机分为:对照组、25ng/mlnt-3组、50ng/mlnt-3组、100ng/mlnt-3组,各组细胞经不同干预因素处理24h后,采用westernblot法检测各组细胞中sox2蛋白表达水平的变化。3.nt-3对nscs分化的影响采用步骤2相同的分组方法,我们进一步观察了外源性nt-3对nscs分化的影响,各组细胞经干预处理24h后,采用westernblot法及if染色法检测不同浓度nt-3对神经干细胞向三系细胞分化的影响。4.pi3k/akt信号通路在nt-3调控sox2蛋白表达中的作用为了进一步探讨pi3k/akt信号通路在nt-3调控sox2蛋白表达中的重要作用,我们将原代培养的神经干细胞随机分为:对照组、10umpi3k/akt通路阻断剂(ly294002)组、100ng/mlnt-3组及ly294002(10um)+nt-3(100ng/ml)组,各组细胞经处理24h后,采用westernblot法检测各组p-akt、akt、sox2及dcx蛋白表达水平。并观察了特异性的pi3k/akt通路阻断剂ly294002能否阻断nt-3上调sox2表达的作用。5.统计学方法所有定量数据以平均值±标准差表示,应用单因素方差分析(anova)进行统计学分析,p值小于0.05为差异有统计学意义。结果1.成功分离培养了具有多向分化潜能的神经干细胞;首先,利用倒置相差显微镜从形态学上进行观察:原代培养的神经干细胞第3d时,可见大量的神经干细胞球呈悬浮状态生长。其次,从神经干细胞分化性能上进行鉴定,免疫荧光染色结果显示:绝大多数原代培养的细胞表达nestin及干性标志物sox2;在分化培养基中培养2d后的nscs可分化为表达神经元前体细胞标志物dcx、少突胶质细胞标志物olig2及星形胶质细胞标志物gfap的三系细胞。2.nt-3上调了nscs中sox2的表达;westernblot检测结果显示:外源性的nt-3可明显上调nscs中sox2的表达,并呈现出明显的剂量依赖性。与对照组相比,较高浓度nt-3(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)处理后的nscs中sox2蛋白表达水平明显上调,差异具有统计学意义(p<0.05)。3.上调后的sox2进一步促进了nscs向神经元的分化;首先,较高浓度的nt-3显著上调了nscs中sox2蛋白的表达水平,westernblot检测结果还表明,随着nt-3浓度的增加,dcx蛋白表达水平也明显增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(p<0.05);另外,50ng/ml及100ng/ml的nt-3同时促进了Olig2蛋白表达水平的上调(P<0.05)。其次,IF检测结果显示:对照组DCX阳性(+)细胞的百分比最低,而各NT-3处理组DCX+细胞的百分比明显增加(P<0.05),并且细胞突起明显增长,细胞之间的联系更加广泛;另外,50 ng/ml NT-3组和100 ng/ml NT-3组Olig2+细胞百分比较对照组也相应增加(P<0.05)。4.NT-3通过上调NSCs中p-Akt蛋白的表达而促进Sox2蛋白表达的上调,后者进一步促进了NSCs向神经元方向的分化。Western blot检测结果显示:与对照组相比,100 ng/ml NT-3处理组的p-Akt蛋白表达水为最高,相应地,Sox2、DCX蛋白表达水平也是最高(P<0.05);为了证明PI3K/Akt通路介导NT-3上调Sox2的特异性,我们使用了特异性的通路阻断剂LY294002(10 uM)来阻断NT-3的作用,结果表明LY294002(10 uM)明显下调了p-Akt及Sox2的蛋白表达水平,相应地,DCX蛋白表达水平也被显著下调(P<0.05)。表明在NSCs中,NT-3通过上调Sox2而促进NSCs向神经元方向分化是通过PI3K/Akt通路调控的。结论1.外源性的NT-3通过上调NSCs中Sox2的表达而促进NSCs向神经元前体细胞和少突胶质细胞方向的分化。2.NT-3通过激活PI3K/Akt信号通路而调控Sox2的表达。3.NT-3上调Sox2的表达具有明显的剂量依赖性。