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目的:多发性骨髓瘤约占血液系统恶性肿瘤的10%,是第二大常见血液系统恶性肿瘤,以浆细胞恶性克隆性增生为表现形式,目前仍然属于不可治愈的疾病。虽然目前随着自体造血干细胞移植术、治疗新药的上市以及新型免疫疗法的应用,多发性骨髓瘤治疗的疗效和患者预后已得到明显改善,5年总生存期得到明显延长,但大多数患者最终仍然以复发为结局。影响多发性骨髓瘤的疾病进展与预后的因素有很多,染色体异常、癌基因突变激活以及骨髓微环境的改变等都在多发性骨髓瘤的发病、进展及预后中起关键作用。但目前尚无判断疾病预后的理想分子指标,探索研究影响预后的因素是目前研究热点。circRNA作为一类新型非编码RNA,是一种共价闭合内源性非编码RNA。它既没有5’末端和3’末端极性,也没有PolyA尾,因此结构稳定,并且不易被核酸内切酶降解。circRNA具有组织和疾病特异性,在癌症发生发展中发挥重要的调节功能,对circRNA的深入研究对揭示肿瘤发生发展具有重要意义。circRNA具有多种生物学功能,包括作为miRNA的“海绵”吸附miRNA、翻译蛋白、调节RNA结合蛋白、调控亲本基因表达等等。目前关于circRNA功能报道最多的是其竞争性结合miRNA,抑制miRNA对下游靶基因的结合,调控靶基因的表达,影响细胞功能与生物学行为,在肿瘤发生进展中起到重要作用。通过生物信息学方法选择3种与癌症相关或者其亲本基因与癌症相关的circRNA,包括circ-CDYL、circ-HIPK3以及circ-ACC1,预实验利用qRT-PCR检测多发性骨髓瘤样本与正常对照样本中这三种circRNA的表达,发现相较于对照组,circ-CDYL在多发性骨髓瘤中稳定高表达,于是选定circ-CDYL作为目的基因进行后续研究。circ-CDYL位于6号染色体上chr6:4891946-4892613,衍生自其亲本基因CDYL的外显子的头尾拼接。有文献报道,circ-CDYL参与调控肿瘤的发生与发展,如circ-CDYL对肝细胞癌发生具有重要的驱动作用,在套细胞淋巴瘤中与疾病进程相关。然而,circ-CDYL在MM中的分子功能和生物学作用目前尚未见报道。本研究通过临床样本检测明确初诊MM患者与正常人之间circ-CDYL的差异性表达,并结合患者临床资料以及随访分析的方法,探讨circ-CDYL用于判断MM预后的可能性及合理性。根据其结构特点及在MM细胞内定位,推测其在MM中生物学功能,并通过细胞实验及动物实验进行验证,对其可能的作用机制进行初步探索。研究方法:1、通过生物信息学方法选择3种与肿瘤相关或者其亲本基因与肿瘤相关的circRNA,并通过Realtime PCR预实验锁定circ-CDYL作为目的基因进行研究,扩大样本量收集,72例MM样本与13例正常对照样本经过Realtime PCR方法检测circ-CDYL的相对表达量,并通过临床数据分析的方法探索circ-CDYL作为MM潜在的预后生物标记物的可能性及合理性。2、慢病毒包装构建稳定的circ-CDYL敲低细胞模型,通过CCK-8法和EdU法检测细胞细胞活力和DNA复制能力,流式细胞学方法检测细胞的凋亡,进一步明确circ-CDYL对骨髓瘤细胞的生物学作用。3、核浆分离分别提取胞核与胞浆RNA,通过Realtime PCR实验确定circ-CDYL在细胞中的定位。4、生物信息学预测可能与circ-CDYL靶向作用的miRNA,Realtime PCR实验检测mi RNA的表达水平,确定miR-1180为下游miRNA,同时检测临床样本中miR-1180的相对表达量,并分析miR-1180与circ-CDYL表达相关性。通过circRNA下拉实验和双荧光素酶报告基因系统进一步验证miR-1180与circ-CDYL的靶向作用。5、生物信息学方法预测YAP基因可能为miR-1180的下游靶基因,通过双荧光素酶报告基因进行验证。6、Realtime PCR实验检测过表达及敲除miR-1180后YAP的m RNA表达情况。7、在稳定沉默circ-CDYL细胞中,瞬时转染miR-1180抑制剂后,Realtime PCR和Western blot检测YAP的mRNA及蛋白的表达,进一步证明miR-1180靶向调控YAP。从而确定circ-CDYL、miR-1180及YAP调控网络8、在稳定沉默circ-CDYL细胞中,瞬时转染miR-1180抑制剂,恢复YAP的表达后,通过EdU法和transwell实验检测细胞增殖和侵袭能力。9、体内实验,构建裸鼠移植瘤模型,检测沉默circ-CDYL对多发性骨髓瘤体内成瘤能力的影响,Realtime PCR实验检测瘤组织内miR-1180和YAP的表达,免疫组化检测YAP与Ki-67表达情况,评估瘤细胞增殖侵袭能力。结果:1、circ-CDYL的差异性表达:与正常对照样本相比,circ-CDYL在初诊多发性骨髓瘤患者的骨髓瘤细胞显著高表达。2、以circ-CDYL相对表达量的中位数分组,结合临床资料分析circ-CDYL表达量与骨髓瘤临床危险因素相关性表明:circ-CDYL表达量与ISS、DS分期密切相关,高表达circ-CDYL组的患者更多的是ISS和DS分期III期,容易伴发高钙血症,并且高表达circ-CDYL组患者的生存时间比低表达circ-CDYL组患者的生存时间短。3、体外细胞实验表明,与对照组相比,沉默circ-CDYL会大大降低MM细胞DNA的合成速率,降低MM细胞的活性,同时促进MM细胞的凋亡。4、核浆分离Realtime PCR实验证明circ-CDYL主要定位于MM细胞质中。5、circRNA下拉实验、双荧光素酶报告基因及Realtime PCR实验表明,miR-1180为circ-CDYL的下游靶标,即circ-CDYL竞争性结合miR-1180。6、双荧光素酶报告基因及Realtime PCR实验验证YAP与mi R-1180的关联性,即miR-1180靶向结合癌基因YAP。7、Realtime PCR和Western Blot实验验证了在沉默circ-CDYL细胞中,YAP mRNA和蛋白水平均被下调,而miR-1180的敲低有效地阻止了这种抑制作用。从而确定circ-CDYL、miR-1180及YAP调控网络。8、在沉默circ-CDYL的细胞中恢复YAP的表达后,细胞的增殖能力和侵袭能力均增强。9、体内实验结果:成功构建裸鼠皮下成瘤模型,沉默circ-CDYL后MM移植瘤体生长减慢,瘤体重量和体积明显减小,瘤组织细胞内mi R-1180上调而YAP表达下调,免疫组化染色显示MM细胞增殖能力下降,侵袭能力下降。同时证明体内也存在circ-CDYL/mi R-1180/YAP调控轴。结论:1、circ-CDYL在初治MM细胞中显著高表达,并且circ-CDYL高表达的患者预后差,可以判断MM的预后。2、circ-CDYL靶向结合miR-1180,与miR-1180表达呈负相关关系。3、miR-1180靶向抑制YAP的3′-UTR区,抑制YAP的表达。4、circ-CDYL在MM细胞中通过靶向结合miR-1180而上调YAP的表达,并促进MM细胞增殖与侵袭。5、动物实验证明体内确实存在circ-CDYL/miR-1180/YAP调控网络。