丁酸在粪菌移植治疗溃疡性结肠炎中的作用及机制研究

来源 :华南理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:JK0803luowei
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目的:本研究基于临床样本和肠炎小鼠模型,发现粪菌移植(Fecal microbiota transplantation,FMT)治疗溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)中重要的菌群代谢物丁酸含量显著增加。通过组学联合分析的方法,探讨丁酸对实验性肠炎的治疗效果,利用菌群体外培养和自噬激活/抑制肠炎小鼠模型,验证FMT通过丁酸介导的肠道菌群调节和自噬激活改善实验性肠炎的可能作用机制。方法:(1)通过12名经FMT治疗UC患者及其对应健康供者的粪便样本,利用16S r RNA测序分析菌群变化,联合液相色谱-质谱联用分析其中5例症状反复患者的粪便靶向短链脂肪酸(Short chain fatty acids,SCFAs)含量变化,并通过FMT治疗葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)诱导的肠炎小鼠,验证FMT治疗UC后产丁酸细菌相对丰度和丁酸含量变化特征;(2)观察丁酸对DSS诱导肠炎小鼠的疾病活动度(Disease activity index,DAI)、结肠缩短程度、结肠HE、结肠屏障蛋白表达、血清炎症因子的影响,进一步通过粪便16S r RNA测序、血清非靶向代谢组、结肠组织RNA-seq分析、体外选择性扩增培养肠炎菌群进行组学联合分析;(3)通过IHC、WB、PCR检测丁酸钠治疗肠炎小鼠后,结肠自噬蛋白含量和转录水平,构建自噬激活肠炎小鼠和自噬抑制肠炎小鼠,通过观察丁酸钠/FMT干预后实验性肠炎改善情况和自噬相关基因表达、自噬相关蛋白含量,判断FMT能否通过丁酸上调自噬水平进而改善实验性肠炎;(4)回顾45例经FMT治疗UC患者的临床数据,观察联用产丁酸益生菌对远期缓解的影响。结果:(1)FMT治疗UC应答患者的粪便中产丁酸细菌(Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Ruminococus、Alistipes、Akkermansia、Roseburia、Faecalibacterium等)相对丰度增加,并且丁酸含量显著升高(FMT后1月vs.FMT前,P=0.028),粪便丁酸含量与患者症状严重程度呈负相关(r=0.5321,P=0.0412);FMT有效改善肠炎小鼠DAI、结肠缩短程度、结肠病理损害和血清IL6和TNF-α水平(P均<0.05),结肠屏障蛋白含量显著增加(ZO-1,P=0.0236,P=0.0186;Occludin,P=0.0106,P=0.0319);FMT上调菌群多样性,促进Ruminococcaceae、Rikenellaceae、Ruminiclostridium、Alistipes、Roseburia、Faecalibacterium_prausnitzii等产丁酸细菌的相对丰度增加,同时下调Bacteroidaceae、Streptococcaceae、Corynebacterium、Escherichia-Shigella等条件致病菌的相对丰度,FMT治疗后的肠炎小鼠肠内丁酸的含量显著增加(P=0.0126)。(2)丁酸钠有效改善肠炎小鼠DAI、结肠缩短程度、结肠HE和血清IL-6、IL-1β和TNF-α平(P均<0.05),IHC(ZO-1,P=0.0075;Occludin,P=0.0113)、WB(ZO-1,P=0.004;Occludin,P=0.0009)提示屏障蛋白显著增加;体内体外实验中,丁酸钠介导肠道菌群多样性上调,调整肠道菌群结构向健康小鼠菌群趋化,表现为Firmicutes、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Rikenellaceae、Ruminiclostridium、Butyricicoccus、Roseburia、Alistipes等产丁酸细菌的相对丰度增加,以及Bacteroidetes、Bacteroidaceae、Enterobacteriaceae、Helicobacteraceae、Enterococcaceae、Bacteroides、Enterococcus、Escherichia-Shigella、Klebsiella、Helicobacter等条件致病细菌的相对丰度下降;非靶向代谢组分析,正/负离子状态下一共发现342种差异代谢物,结肠RNA-seq检出差异基因106个,进一步利用差异代谢物与结肠差异基因进行关联分析,进行KEGG富集分析筛选出目标信号通路4个:Autophagy(ko04140)、Regulation of lipolysis in adipocyte(ko04923)、Ovarian steroidogenesis(ko04913)、Biosynthesis of amino acids(ko01230)。(3)丁酸钠治疗DSS诱导肠炎小鼠实验中,FMT后结肠IHC提示P62(P=0.0164)和p-MTOR(P=0.0325)显著减少,WB提示P62(P=0.0184)、p-MTOR(P=0.0024)显著减少、LC3-II/I(P=0.0024)显著增加,PCR提示P62(P=0.0162)表达显著下降、TFEB(P=0.0007)和ATG16L1(P=0.0062)表达显著增加;雷帕霉素激活自噬可以改善实验性肠炎:DAI(P=0.0128)、结肠缩短程度(P=0.043)、结肠HE(P=0.0392)、血清炎症因子水平(IL-6,P=0.0396;TNF-α,P=0.0164),相反羟氯喹抑制自噬则加重部分实验性肠炎指标:DAI(P=0.0027)、结肠缩短程度(P=0.0393)、结肠HE(P=0.765)、血清炎症因子(IL-6,P=0.205;TNF-α,P=0.7863);丁酸钠/FMT干预后,自噬抑制肠炎小鼠的部分肠炎指标好转:DAI(P=0.5130;P=0.6926)、结肠缩短程度(P=0.009;P=0.0008)、结肠HE(P=0.0028;P=0.0015)、血清炎症因子(IL-6,P=0.0159,P=0.0037;TNF-α,P=0.0714,P=0.0623);结肠IHC(P62,P=0.0468,P=0.1183;LC3B,P=0.0118,P=0.0117;MTOR,P=0.1083,P=0.0134;p-MTOR,P=0.0618,P=0.2508;ATG16L1,P=0.0203,P=0.0176)、WB(P62,P=0.0472,P=0.3440;LC3-II/I,P=0.0808,P=0.0287;MTOR,P=0.2696,P=0.3103;p-MTOR,P=0.9668,P=0.6356;ATG16L1,P=0.5863,P=0.0499)和PCR(P62,P=0.0202,P=0.006;LC3,P=0.0113,P=0.0033;TFEB,P=0.0003,P=0.0039;ATG16L1,P=0.0401,P=0.001)提示丁酸钠和FMT均可以上调自噬表达。(4)45例FMT治疗UC病例在FMT后3个月,11名联用丁酸梭菌制剂的患者有9名保持临床缓解,34名未联用丁酸梭菌制剂的患者有15名患者处于临床缓解(χ~2=3.9477,P=0.0469)。结论:粪便丁酸可能是FMT治疗UC后重要的疗效标志物;FMT可能通过丁酸介导的菌群调节作用改善实验性肠炎;FMT可能通过丁酸激活自噬改善实验性肠炎;联合丁酸相关的益生菌或许可以延长FMT治疗UC的远期缓解。
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