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牙髓炎是口腔临床最常见的疾病之一,如得不到及时治疗会发展为根尖周炎,通常以剧烈疼痛为主要症状,严重影响人们的生活质量。2000年,有学者从健康牙髓中分离出牙髓干细胞。近年来,研究者又从炎症牙髓中分离出牙髓干细胞,但其增殖能力及牙向/骨向分化潜能均低于正常牙髓组织。黄芩苷是传统中药黄芩的主要成分,有抑菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等活性。黄芩苷可抑制P.g LPS诱导的人口腔黏膜角化细胞中IL-6/8产生;可抑制由LPS诱导的人牙髓细胞TLR4的表达及TNF-α的分泌;在牙周炎模型中,可降低骨吸收和胶原的破坏。这些研究结果提示,黄芩苷在治疗炎症及修复损伤愈合具有很好的效果及应用前景,但是其对牙髓炎的抗炎及修复机制仍不明确。因此,本课题拟通过分析黄芩苷对炎症牙髓干细胞增殖及牙向/骨向分化能力的影响及机制的初步探讨,为临床应用提供参考。第一部分炎症牙髓干细胞的生物学行为分析研究目的:分析炎症牙髓干细胞生物学行为的改变。研究方法:酶消化法及有限稀释法分离培养、纯化正常牙髓干细胞(normal dental pulp stem cells,nDPSCs)及炎症牙髓干细胞(inflammatory dental pulp stem cells,iDPSCs)。细胞角蛋白(CK)、波形丝蛋白(Vimentin)免疫荧光染色,验证其间充质干细胞特性。实时定量逆转录聚合酶链式反应实验(Real-time RT-PCR)检测nDPSCs,iDPSCs及LPS组细胞炎症因子(IL-1β、TNF-α)的表达情况。蛋白免疫印迹实验(Western blot)及real time RT-PCR检测牙向/骨向分化相关基因蛋白(RUNX2/RUNX2、DSPP/DSP、OSX/OSX、OPN/OPN、OCN/OCN)的表达情况。实验结果:nDPSCs与iDPSCs CK染色呈阴性,Vimentin染色阳性。iDPSCs与LPS组的炎症因子(IL-1β、TNF-α)的表达水平均高于nDPSCs组,差异具有统计学意义(P<0.05)。碱性磷酸酶活性及牙向/骨向相关基因蛋白(RUNX2/RUNX2、DSPP/DSP、OSX/OSX、OPN/OPN、OCN/OCN)的表达水平均较nDPSCs组降低。结论:本实验成功分离出炎症牙髓干细胞。其炎症因子IL-1β,TNF-α的表达水平明显增高,但牙向/骨向分化能力降低。第二部分黄芩苷对炎症牙髓干细胞增殖及牙向/骨向分化的影响研究目的:分析黄芩苷对炎症牙髓干细胞增殖及牙向/骨向分化能力的影响。研究方法:采用四甲基偶氮噻唑盐(MTT)法检测黄芩苷浓度为0,10,20,50,100μM时,各组细胞培养5d时的OD值,筛选出对iDPSCs的最适黄芩苷浓度。实验分为三组:正常牙髓干细胞组(nDPSCs),炎症牙髓干细胞组(iDPSCs),黄芩苷作用炎症牙髓干细胞组(黄芩苷组)。实时定量逆转录聚合酶链式反应实验(real time RT-PCR)检测各组炎症因子IL-1β,TNF-α的表达情况。检测nDPSCs,iDPSCs及黄芩苷组细胞连续培养0,1,3,5,7,9d时的OD值,并绘制细胞生长曲线。流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布,计算细胞增殖指数(PI),检测黄芩苷对炎症牙髓干细胞增殖能力的影响。检测各组细胞培养3,5,7d时碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色检测成骨诱导液诱导各组细胞21d时的钙结节形成情况,提取各组细胞总RNA和总蛋白,real time RT-PCR检测牙向/骨向分化相关基因(RUNX2、DSPP、OSX、OPN、OCN)的表达情况,蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测牙向/骨向分化相关蛋白(RUNX2、DSP、OSX、OPN、OCN)的表达情况。通过以上实验筛选黄芩苷的最佳作用浓度,明确黄芩苷对炎症牙髓干细胞炎症因子的表达情况,增殖及牙向/骨向分化能力的影响。实验结果:黄芩苷作用5d时,浓度为0~20μM对iDPSCs的增殖无明显影响,当浓度大于20μM时表现为抑制细胞增殖,结合参考文献选用20μM作为本实验黄芩苷的作用浓度。用20μM黄芩苷作用iDPSCs时,其炎症因子IL-1β,TNF-α的表达水平明显下调(P<0.05)。iDPSCs及黄芩苷组增殖能力较nDPSCs增高,而两组间未见明显差异。iDPSCs组ALP活性、矿化结节形成量均较nDPSCs少,而黄芩苷组ALP活性、矿化结节形成量均增加,CPC定量分析显示,差异具有统计学意义(P<0.05),黄芩苷组牙向/骨向分化相关基因蛋白(RUNX2/RUNX2、DSPP/DSP、OSX/OSX、OPN/OPN、OCN/OCN)表达均较iDPSCs上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:iDPSCs的增殖能力高于nDPSC,20μM黄芩苷对iDPSCs的增殖无明显影响,但可下调其炎症因子的表达,促进iDPSCs牙向/骨向分化能力。第三部分黄芩苷通过NF-κB及Wnt信号通路调控炎症牙髓干细胞牙向/骨向分化的机制研究研究目的:探讨黄芩苷通过NF-κB及Wnt信号通路调控iDPSCs牙向/骨向分化的作用机制。研究方法:检测nDPSCs,iDPSCs和黄芩苷组NF-κB通路相关蛋白(IκBα、p-IκBα、P65、p-P65)与Wnt通路相关蛋白(β-catenin、GSK3β、CaMKII、NLK)的表达情况。检测NF-κB通路抑制剂(BMS345541),β-Catenin/Wnt信号通路抑制剂(DKK1)及黄芩苷对iDPSCs牙向/骨向分化相关基因蛋白(RUNX2/RUNX2、DSPP/DSP、OSX/OSX、OPN/OPN、OCN/OCN)的表达情况。研究结果:Western blot结果显示:iDPSCs胞浆中p-IκBα,p-P65表达较nDPSCs高,且胞核中P65表达也上调,黄芩苷组胞浆中p-IκBα,p-P65表达及胞核中P65表达与iDPSCs组相比降低;β-catenin/Wnt与非经典Wnt信号通路相关蛋白β-catenin的表达水平升高,GSK3β、CaMKII、NLK的表达降低,黄芩苷组β-catenin蛋白的表达降低,GSK3β、CaMKII、NLK的表达升高。经BMS345541及DKK1抑制通路,iDPSCs牙向/骨向分化相关基因蛋白(RUNX2/RUNX2、DSPP/DSP、OSX/OSX、OPN/OPN、OCN/OCN)的表达均上调,与黄芩苷组结果相一致。结论:黄芩苷可以通过抑制NF-κB及β-catenin/Wnt信号通路部分缓解或纠正由炎症引起的DPSCs分化能力下降。