Parkin介导突变型ataxin-3蛋白非经典泛素化参与SCA3发病的机制研究

来源 :郑州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:suishi2001
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背景:脊髓小脑共济失调 3 型(Spinocerebellar ataxia type 3,SCA3),又称 Machado-Joseph病,是最常见的遗传性共济失调。该病由ATXN3基因10号外显子的CAG串联重复序列异常重复扩增突变所致。ATXN3编码的ataxin-3蛋白为一种去泛素化酶,突变后导致ataxin-3蛋白的多聚谷氨酰胺片段(Polyglutamine,PolyQ)异常延长,突变蛋白发生错误折叠,并在神经元内聚集,形成泛素阳性的包涵体。目前,SCA3发病机制仍不清楚,且无有效治疗手段。泛素化是一种常见的翻译后修饰,是将泛素分子通过一系列酶促反应结合到底物蛋白的过程,对维持蛋白质量控制系统具有重要作用。经典的泛素化通过K48特异的泛素链诱导底物蛋白通过蛋白酶体降解,K63等泛素链介导的非经典的泛素化可激活自噬信号,促进底物蛋白通过自噬溶酶体途径降解。Ataxin-3的去泛素酶活性和突变型ataxin-3形成的泛素阳性包涵体高度提示泛素化异常可能在SCA3发病机制中起到重要作用。PARK2是常染色体隐性遗传帕金森病的一种重要致病基因,其编码的parkin蛋白是一种RBR(RING-between-RING)E3泛素连接酶,可催化多种重要底物蛋白形成不同泛素链,如K48-,K63-等特异的泛素链,诱导底物蛋白通过蛋白酶体或者溶酶体降解,是蛋白质量控制系统中泛素-蛋白酶体通路和自噬-溶酶体通路中的重要调控因子。既往研究显示,Parkin介导的泛素化修饰参与帕金森病、阿尔兹海默病、肌萎缩侧索硬化等多种神经退行性疾病的发病过程。目前,parkin参与SC A3发病机制的尚不完全清楚。目的:为探讨Parkin介导的泛素化在SCA3疾病中的发病机制,我们拟通过研究parkin蛋白对ataxin-3蛋白的泛素化作用,探讨parkin蛋白在突变型ataxin-3蛋白降解、聚集过程中的作用和机制。同时,探讨ataxin-3突变对parkin蛋白表达的影响及可能机制。方法:1.通过免疫共沉淀实验,在SCA3细胞模型中研究parkin蛋白与野生及突变型ataxin-3蛋白的相互作用,及突变的PolyQ结构域对其相互作用强度的影响;通过体内泛素化实验研究parkin蛋白对野生及突变型ataxin-3的泛素化作用及泛素链类型。2.基于parkin蛋白通过K63特异泛素链泛素化突变型ataxin-3蛋白,进一步研究parkin蛋白对突变型ataxin-3蛋白稳定性、包涵体形成和降解的作用;研究parkin蛋白对突变型ataxin-3蛋白诱导细胞毒性的影响。3.在SCA3细胞模型中研究ataxin-3蛋白突变对parkin蛋白稳定性的影响及具体机制;研究parkin下调对突变型ataxin-3蛋白泛素化、蛋白水平、蛋白分布和突变蛋白诱导细胞毒性的影响。4.在SCA3转基因小鼠脑组织中检测parkin蛋白水平、整体泛素水平及蛋白酶体活性。结果:1.野生及突变型ataxin-3蛋白与Parkin蛋白均存在相互作用,且突变型ataxin-3蛋白增强了其与parkin蛋白的相互作用;野生及突变型PolyQ片段均与parkin蛋白存在相互作用,且突变型PolyQ结构域增强了其与parkin蛋白的相互作用;过表达parkin蛋白可以促进突变型ataxin-3蛋白的泛素化,但对野生ataxin-3蛋白的泛素化作用不明显。parkin主要通过K63特异的泛素链泛素化突变型ataxin-3蛋白。2.Parkin蛋白促进突变型ataxin-3蛋白通过自噬溶酶体降解,降低突变型ataxin-3蛋白水平,缓解突变蛋白诱导的细胞毒性;在蛋白酶体功能受抑制条件下,parkin蛋白促进突变型ataxin-3蛋白聚集形成包涵体,并诱导其通过自噬溶酶体通路降解。3.突变型ataxin-3蛋白诱导parkin蛋白通过自噬溶酶体降解,下调parkin蛋白水平;parkin蛋白下调可抑制突变型ataxin-3的泛素化,导致突变型ataxin-3蛋白水平升高,影响突变蛋白包涵体形成和清除,进一步加重突变蛋白诱导的细胞毒性。4.SCA3转基因小鼠脑组织中parkin蛋白水平下降,整体K63泛素水平升高伴有蛋白酶体功能障碍。结论:1.Ataxin-3蛋白突变增强了其与parkin蛋白的相互作用;parkin通过K63特异的泛素链泛素化突变型ataxin-3蛋白。2.Parkin促进突变型ataxin-3蛋白聚集形成包涵体,并诱导其通过自噬溶酶体降解,对SCA3具有保护作用。3.Ataxin-3突变诱导parkin蛋白通过自噬溶酶体降解而下调parkin蛋白,导致突变型ataxin-3蛋白泛素化异常和清除障碍,进一步加剧了突变型ataxin-3蛋白的细胞毒性。4.SCA3小鼠脑组织中parkin蛋白水平下调,整体K63特异泛素水平升高。
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