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miRNA是一类非编码的小RNA分子，平均21个核苷酸大小，通过抑制mRNA翻译或直接降解mRNA，来调节基因的表达。据报道，miRNA在基因转录后调控卵巢发育，在卵泡发育、黄体成熟过程中发挥了关键作用。本研究通过对二花脸和大白猪卵泡组织Solexa测序结果比对分析，获得了在两个猪种中差异表达miR-331*。通过对miR-331*进行序列分析、靶基因预测、功能分析以及根据相关文献的报道，预测出线粒体基因细胞色素B（Cytochrome B，CYTB）可能是miR-331*的靶基因。线粒体存在于大部分真核细胞中，不仅是细胞的供能中心，而且还参与细胞代谢、细胞程序性死亡、细胞分化等重要的生命过程。本课题通过研究miR-331*及其靶基因在母猪排卵过程中发挥的调控作用及机制，为提高母猪繁殖性能提供理论依据。主要研究结果如下: 1.miR-331*与其靶基因CYTB靶向关系的验证 构建包含有miR-331*结合位点的pmirGLO-CYTB-WT双荧光素酶报告载体和含有miR-331*结合位点的pmirGLO-CYTB-mut双荧光素酶报告载体。分别将miR-331*mimics和双荧光素酶报告载体共转染CHO细胞，测定荧光活性，结果表明miR-331*能与CYTB基因结合。 实时定量PCR检测细胞中CYTB mRNA的表达量。结果显示:与对照组相比，miR-331*mimic能上调CYTB mRNA的表达量。Western Blotting的结果表明:miR-331*mimic能上调CYTB蛋白的表达。CYTB-siRNA能抑制CYTB蛋白的表达。 2.miR-331*与其靶基因CYTB功能的研究 通过MTT法检测CHO细胞在不同时间段(24h，48h，96h)的细胞增殖情况。结果显示，超表达miR-331*，在不同时间段(24h，48h，96h)细胞增殖程度均有显著的下降;抑制CYTB表达后，细胞增殖下降不显著。这说明CYTB基因抑制细胞增殖。通过用流式细胞仪检测它们对CHO细胞凋亡的影响。超表达miR-331*后，细胞早期凋亡百分比相对NC组呈上升趋势;抑制CYTB表达后，细胞早期凋亡百分比相对NC组呈降低趋势。这说明CYTB基因促进CHO细胞凋亡。超表达miR-331*后CHO细胞凋亡蛋白Bax的表达量随之增加，而Bcl-2蛋白质的表达量则差异不显著;抑制CYTB表达后，CHO凋亡蛋白Bax的表达量降低，而Bcl-2蛋白质的表达量则增加，这与前面细胞凋亡指数的结果是相符合的。 通过流式细胞仪检测CHO细胞的周期:超表达miR-331*后CHO细胞周期G1期显著增长，S期显著缩短;抑制CYTB表达后，CHO细胞周期G1期显著缩短，S期显著增长。通过ELISA直接检测经过处理后的细胞中ATP的含量，结果显示:超表达miR-331*，CHO细胞中ATP含量显著下降;抑制表达CYTB时，CHO细胞中的ATP含量变化不显著。通过Western blot检测细胞损伤蛋白H2AX的表达情况。超表达miR-331*后，CHO细胞中H2AX的表达量显著增加;抑制CYTB表达后，CHO细胞中H2AX的表达量显著降低，说明CYTB促进DNA损伤。通过Western blot检测ERK磷酸化情况。Western blot结果表明:在转染miR-331*mimic后，ERK磷酸化相对NC组呈降低趋势;转染CYTB-siRNA后，ERK磷酸化与NC组相比呈降低趋势，但差异不显著。 细胞色素C释放到细胞浆中，激活caspase，从而诱导细胞凋亡。Caspase能灭活或下调与DNA修复有关的酶，阻断细胞DNA复制和修复，从而影响细胞增殖、细胞周期。我们的研究发现:miR-331*及其靶基因CYTB通过调节氧化磷酸化产生ATP来影响细胞色素C释放，调节细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期等细胞活动。