摘要：间隙连接连接相邻细胞的细胞质,介导离子、代谢产物、信使分子等小分子物质(分子量≤1kDa)在相邻细胞之间进行直接交换。间隙连接介导的物质和信息的交换在细胞增殖和分化等许多生理事件的发生中有着重要作用。间隙连接由间隙连接蛋白组成。间隙连接蛋白基因的突变导致一系列的遗传性疾病。编码间隙连接蛋白31(connexin31, Cx31)的基因的突变导致变异性红斑角化病(Erythrokeratodermia Variabilis, EKV),神经性耳聋及神经性耳聋-周围神经病。目前,Cx31基因突变致病的分子机制仍不清楚。本研究的目的是利用果蝇和小鼠模型来研究Cx31基因突变导致EKV的分子病理机制。我们建立了携带人野生型Cx31(Cx31WT)或EKV致病突变Cx31F137L的编码序列的转基因果蝇,并通过Gal/UAS系统把转基因表达在果蝇的细胞。在果蝇眼睛中,过表达Cx31WT不导致异常表型,过表达Cx31F137L导致果蝇眼睛色素丢失和单眼变性；免疫染色和免疫印迹分析显示Cx31WT能形成间隙连接,而致病突变Cx31F137L影响间隙连接形成；而且,Cx31F137L被快速降解。这与在哺乳动物细胞中的发现一致。在哺乳动物细胞中,Cx31WT能形成间隙连接；Cx31F137L不形成间隙连接,并且被快速降解。这就提示Cx31F137L过表达果蝇可用作Cx31相关EKV的疾病模型。通过候选“遗传筛查”,我们发现分子伴侣Bip和Hsp70能显著的抑制Cx31F137L引起的果蝇表型；免疫染色和免疫印迹分析显示,Bip和Hsp70都能抑制Cx31F137L的快速降解,并促进Cx31F137L间隙连接的形成。所有这些结果提示,EKV相关的Cx31基因突变影响Cx31的折叠,而非折叠/异常折叠蛋白诱导的内质网应激构成EKV相关Cx31突变体的致病机制。我们建立了在皮肤表皮角质形成细胞表达人野生型Cx31的转基因小鼠。该Cx31过表达小鼠表现与EKV病人类似的皮肤表型,包括皮肤过度角化和出现皮肤红斑。组织学分析显示Cx31过表达小鼠的皮肤表皮异常增厚,角质形成细胞数目增加以及角化层有细胞核残留。深入分析显示,Cx31过表达导致表皮角质形成细胞的过度增值和异常分化。在分子水平上,Cx31过表达小鼠的表皮角质形成细胞中分子伴侣Bip和Hsp70、Cx26、转录因子c-Fos/JunB等表达上调。组织化学分析显示,EKV病人皮肤表皮角质形成细胞中,这些蛋白的表达也比健康对照高。这些结果表明Cx31过表达小鼠和EKV病人的皮肤表皮中发生了相似的分子事件,提示该Cx31过表达小鼠可用作EKV的疾病模型。c-Fos/JunB在小鼠模型和EKV病人皮肤中表达上调,而且我们发现c-Fos/AP-1抑制剂T-5224能显著改善Cx31过表达小鼠的皮肤表型。这些结果表明,c-Fos/JunB的表达上调在EKV的发生中起着至关重要的作用,通过小分子化合物抑制c-Fos/AP-1的转录活性是治疗EKV病的潜在手段。来自对EKV果蝇模型,小鼠模型和对EKV病人病变皮肤的研究结果表明,Cx31和Cx26协调调节皮肤的稳态；EKV相关的Cx31致病突变或Cx31高表达引起内质网应激,诱导转录因子c-Fos/AP-1的表达上调,导致c-Fos/AP-1靶基因表达异常,从而导致角质细胞过度增殖和异常分化,最终导致疾病。本研究建立了EKV果蝇模型和小鼠模型,发现了Cx31相关EKV的病理发生机制。此外,本研究鉴定了一种可以显著改善EKV小鼠模型病理表型的小分子化合物,为治疗EKV病提供了实验依据。