细胞衰老是其功能渐进性失调、抵抗疾病能力丧失及内环境稳态失衡的过程,是细胞的结局之一,也是发育成熟的标志。环境中外源的氧化应激会加速衰老的进程,导致细胞、组织和个体呈现早衰表型。线粒体属于半自主性细胞器,线粒体中活性氧水平的增加在衰老中发挥关键作用,能够以多种方式与表观遗传学调控机制相互作用,促进机体的衰老进程。这一过程受到表观遗传学复杂而精致的调控,且与基因表达图谱改变密切相关。早衰发生的表观遗传学变异是其触发因素或是伴随的后果仍不清楚。表观遗传学调控作为环境因素与基因组修饰之间的桥梁,机体经表观遗传学修饰的基因组中包含适应的或有害的双向生物学效应,这一作用或持久或可遗传,但可以改变。线粒体表观遗传学（mitoepigenetics）是指线粒体自身编码的基因发生表观遗传修饰,如mtDNA甲基化和羟甲基化等修饰;以及线粒体与细胞核的代谢产物对线粒体进行表观遗传学调控,包括非编码RNA调控或核编码线粒体相关功能基因启动子区甲基化修饰等。系统深入研究早衰过程中线粒体表观遗传学调控机制,有助于揭示衰老及其相关疾患发生的内在原因,并为早期的线粒体表观遗传靶向干预提供可能,具有重要的科学意义。1.研究目的:探讨人胚肺成纤维细胞（Human Embryonic Lung Fibroblasts,HEFs）复制性衰老和过氧化氢诱导的早衰过程中线粒体生物学性状的改变、线粒体DNA甲基化微环境的变化特征及其核心转录调控因子的表观遗传学修饰情况;寻找人胚肺成纤维细胞早衰过程中mtDNA表观遗传修饰密码;并为细胞早衰及年龄相关疾患的线粒体毒性评价及其可能的表观遗传学干预提供理论依据。2.材料与方法:2.1受试物及处理方法实验用受试物为400μmol/L浓度的过氧化氢,首先用磷酸盐缓冲液将质量分数为30%的过氧化氢配制成的10 mmol/L的中间浓度,然后根据加入细胞培养瓶中不含血清的低糖培养基体积,将过氧化氢染毒浓度调整为400μmol/L,染毒液均新鲜配制,并于4℃低温避光储存。2.2细胞株正常人胚肺成纤维细胞,细胞编号为CCC-HCF-1,取材自引产的15周胚胎组织,购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心,XY=46,10 PDL（population doubling levels,PDL）。2.3细胞培养及分组人胚肺成纤维细胞无菌培养于L-DMEM完全培养基中,培养箱条件严格控制在37℃、95%的相对湿度,及5%CO2。当细胞融合度达到90%时按1:4进行细胞传代,并进行细胞计数。基于本课题组已成功建立的细胞衰老模型,正常人胚肺成纤维细胞的年轻细胞组为22PDL,中年细胞组为35PDL,复制性衰老细胞组为49PDL;当22 PDL细胞组正常培养至其50%融合度时,使用400μmol/L H2O2染毒,每天一次,每次2h,连续染毒4d获得细胞早衰起始组（premature senescence initiation group,PSi）;停止染毒并继续正常培养7 d后获得细胞早衰持续组（premature senescence persistence group,PSp）。本研究共有5个细胞组:22PDL（年轻细胞组）、35PDL（中年细胞组）、49PDL（老年细胞组）,PSi（细胞早衰起始组）和PSp（细胞早衰持续组）。2.4研究方法2.4.1检测H2O2诱导细胞早衰过程中的线粒体一般生物学性状改变基于体外培养的正常人胚肺成纤维细胞复制性衰老及H2O2诱导的细胞早衰模型,观察细胞线粒体一般生物学性状的变化特征。衰老相关特异性β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞衰老情况;应用激光共聚焦显微镜观察各组细胞内线粒体定位及其相对含量的变化;应用化学发光检测仪间接测定各组细胞的萤光强度而确定ATP含量;采用ELISA方法检测各组细胞线粒体8-OHdG含量;采用实时荧光定量PCR方法检测各细胞组mtDNA拷贝数（mitochondrial DNA copy number,mtCN）的变化。2.4.2探讨细胞早衰中线粒体DNA甲基化的表观遗传微环境变化特征及其调控采用ELISA比色定量法定量检测各组细胞的mtDNA总体甲基化水平;使用多功能荧光检测分析仪测定并计算线粒体中总DNA甲基化转移酶（mtDNMTs）活性;应用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞mtDNMT1 mRNA表达水平变化;采用Western blot方法进一步观察线粒体中与mtDNA甲基化过程相关的mtDNMT1、DNMT3A及MBD2的蛋白变化情况。2.4.3细胞早衰中线粒体核心转录调控因子表达及其启动子区甲基化水平改变采用实时荧光定量PCR方法检测线粒体转录复合体TFAM、TFB2M、POLRMT及NRF1 mRNA表达水平;通过Western blot方法检测细胞总蛋白及线粒体总蛋白中TFAM、TFB2M、NRF1和POLRMT等线粒体转录因子的蛋白表达变化;针对线粒体核心转录调控因子TFAM和TFB2M基因进行亚硫酸氢盐修饰处理后测序（bisulfite treatment sequencing,BSP）方法,对其启动子区CpG岛的甲基化状态进行分析。2.4.4细胞早衰中线粒体DNA甲基化免疫沉淀测序分析mtDNA的甲基化片段应用线粒体甲基化DNA免疫沉淀（mtMeDIP-sequencing）检测各组细胞mtDNA甲基化总体状态;并通过生物信息学分析线粒体基因组中mtDNA甲基化在早衰发生中可能涉及的表观遗传调控关键分子事件,并找出衰老相关线粒体DNA差异甲基化基因。2.4.5统计学方法所有的实验数据来自3次或以上独立重复的实验结果。使用GraphPadPrism7软件进行绘图。统计学分析采用SPSS13.0软件,数据采用均数±标准差的形式表示,组间数据比较采用完全随机方差分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。3结果3.1 H2O2诱导细胞早衰中线粒体毒性作用在细胞衰老过程中,线粒体均紧密分布在细胞核周围,并向核两边呈弥散性分布,中年细胞组35PDL线粒体数量最多,早衰起始组PSi线粒体数量最少;与22PDL相比,35PDL的ATP含量无变化,49PDL与PSi的含量下降较快,两组细胞ATP含量接近,早衰持续组PSp的ATP含量高于22PDL。35PDL与PSp的线粒体8-OHdG含量无差别,与22PDL比较相对较低,而49PDL和PSi的线粒体8-OHdG含量较高,两组间差异无统计学意义。荧光定量PCR检测mtDNA拷贝数mtCN发现35PDL、49PDL与PSp均高于22PDL,PSi与22PDL相比显著降低,差异具有统计学意义,均有P值<0.05。3.2细胞早衰中线粒体DNA表观遗传微环境的变化特征及其内在调控机制在细胞复制性衰老中,35PDL的mtDNA总甲基化水平升高,而49PDL的mtDNA甲基化水平随着衰老而快速降低;而在过氧化氢诱导的细胞早衰过程中,氧化应激导致PSi的甲基化水平低于22PDL,PSp的mtDNA甲基化水平与PSi相比,差异无统计学意义（P>0.05）。mtDNMTs总活性在细胞复制性衰老中逐渐升高,在早衰过程中PSi的表达水平快速降低,而PSp的相对表达水平又逐渐升高。在细胞复制性衰老中,mtDNMT1的mRNA表达水平在细胞复制性衰老中随着细胞代龄逐渐升高,而在早衰过程中PSi的表达降低,在PSp组又升高至与22PDL一致水平。在线粒体蛋白中,35PDL和49PDL的mtDNMT1蛋白表达水平高于22PDL,PSi与PSp低于22PDL;对于DNMT3A,35PDL的表达水平仍显著高于22PDL,49PDL与PSi低于22PDL,PSp与22PDL差异无统计学意义（P>0.05）。MBD2蛋白表达结果显示,35PDL组的表达水平高于22PDL,而49PDL、PSi与PSp均低于22PDL（P<0.05）。3.3早衰中线粒体核心转录调控因子表达及其启动子区甲基化状态在细胞复制性衰老过程中,与22PDL相比,35PDL的TFAM、TFB2M及POLRMT等转录因子mRNA水平升高,NRF1表达水平降低;而49PDL的转录因子水平低于22PDL,NRF1却升高;在早衰过程中,PSi组线粒体转录因子及NRF1表达水平均低于22PDL,PSp的TFAM与TFB2M表达水平高于22PDL,但其POLRMT和NRF1表达水平低于22PDL;TFAM、TFB2M、POLRMT及NRF1的蛋白表达与其对应的mRNA表达趋势一致。在线粒体蛋白中,22PDL的TFAM表达量最高,49PDL、PSi与PSp三组均低于22PDL,且组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;TFB2M的蛋白表达显示,35PDL高于22PDL,49PDL与22PDL相比无差异,PSi与PSp两组比较无差异但表达水平均低于22PDL;35PDL的POLRMT表达水平显著高于22PDL,且49PDL与PSi高于22PDL,但低于35PDL（P<0.05）,49PDL与PSi两组比较无差异,PSp表达水平与22PDL无差别（P>0.05）。在NRF1中,35PDL和49PDL表达高于22PDL,但PSi与PSp表达均低于22PDL,各组间比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。TFAM启动子区CpG位点甲基化比例在不同衰老细胞组比较,差异无统计学意义（P>0.05）,并且甲基化程度比例小于1%;对于TFB2M 49PDL转录调控区的CpG岛甲基化位点比例高于22PDL和PSp,而22PDL与PSp相比差异无统计学意义,TFB2M转录调控区域的CpG岛甲基化参与其mRNA表达水平的调控。3.4早衰中mtDNA甲基化测序分析其甲基化片段mtDNA甲基化5-mC免疫沉淀联合测序发现,22PDL、49PDL与PSp的mtDNA甲基化修饰丰度变化存在差异。22PDL与PSp发生特异mtDNA甲基化的片段基本一致,49PDL的特异mtDNA甲基化片段为ND5与ND6;共有的mtDNA甲基化发生片段有ND1、2,COX2、3,ATP6、8,ND4,ND4L,ND5、6以及CYB。KEGG pathway分析特异mtDNA甲基化片段涉及氧化磷酸化、帕金森疾病、阿兹海默综合症、亨廷顿疾病以及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）等年龄相关疾患。在GO（the Gene Ontology project,GO）分析中,生物过程主要涉及有氧化磷酸化与ATP代谢过程;细胞成分显示主要涉及有线粒体内膜蛋白复合物与呼吸链;主要分子功能涉及NADH脱氢酶活性与氧化还原酶活性。4结论4.1 H2O2诱导人胚肺成纤维细胞早衰中具有一定程度的线粒体毒性。4.2 H2O2诱导细胞早衰与复制性衰老的线粒体表观遗传微环境特征存在差异。4.3衰老阶段线粒体核心转录调控因子表达降低。TFB2M转录调控区域甲基化参与其mRNA表达调控。4.4细胞早衰与复制性衰老均涉及相同mtDNA片段甲基化水平的降低（ND1、ND2、ND4、ND4L、ND5、ND6、COX1～3、ATP6、ATP8、CYB及D-loop）;但早衰中COX1甲基化水平升高。衰老中mtDNA甲基化改变参与氧化磷酸化和ATP代谢相关的NADH脱氢酶家族。