微孢子虫（Microsporidia）是一类专性细胞内寄生的单细胞真核微生物,目前已发现200个属,1500多个种,能够感染几乎所有的动物,包括人类,因此被美国疾控中心（CDC）列为生物防卫B类优先病原。家蚕微粒子虫是第一种被鉴定的微孢子虫,是家蚕微粒子病的病原,因其既可水平传播,又可经卵垂直传播,对蚕业生产危害巨大,但其侵染致病的分子机理仍待阐明。高通量测序技术的发展大大推进了微孢子虫基因组的解析,然而因缺乏相应的体外培养、遗传操作体系和微孢子虫基因功能的研究效手段,从而严重阻碍了其侵染机制的解析。孢原质是微孢子虫极管弹出的孢子内容物,是微孢子虫侵染和增殖的起始形式,因此孢原质是微孢子虫由休眠态向增殖态转变过程中非常重要的形态和发育阶段。然而,关于孢原质的特征、感染性及其侵染机制尚不明确。本研究利用家蚕微粒子虫可以体外诱导发芽的特点,建立了孢原质体外分离方法,并对其形态、结构、基因表达和与宿主细胞的相互作用等特征进行了深入分析,并开展了孢原质的体外培养及遗传转化研究,主要结果如下:1、家蚕微粒子虫孢原质的分离及其特征成功建立了以KOH为发芽液的孢原质分离纯化方法。观察发现,孢原质在刚从极管弹出时,其形态不规则,大小从2.7到5.2μm不等,无折光性,之后逐渐呈球形,直径约为3.64±0.41μm与休眠孢子长径大小相近,表明我们成功分离获得了家蚕微粒子虫孢原质。利用CCK-8进行检测发现,孢原质仍然具有代谢活性,因此可以用于之后的体外培养。透射电镜结果显示,孢原质由单层细胞膜包裹,细胞核为双核,且紧靠细胞膜。同时还发现在孢原质内存在三个细胞核的现象。对细胞核大小进行测量发现,孢原质和休眠孢子的细胞核大小分别为0.59±0.05μm和0.78±0.07μm,存在显著性差异,表明孢原质中的细胞核可能发生了压缩,推测与有利于快速通过极管有关。进一步分析发现,孢原质质膜不能被麦胚凝集素标记,并且细胞核可以被台盼蓝和碘化丙啶（PI）染色,表明孢原质质膜的组成不同于正常细胞质膜,没有凝集素结合位点,且具有更强的膜通透性,利于微孢子虫适应胞内寄生生活。2、家蚕微粒子虫孢原质的基因表达特征利用RNA-seq对家蚕微粒子虫休眠孢子（MS）和孢原质（SP）进行转录组测序分析,分别获得了146 865 590和135 344 316条高质量的reads,与参考基因组的匹配率分别为82.54%和83.18%。对MS和SP组的基因表达进行比较分析,共筛选到541个显著差异表达基因（padj<0.05）,孢原质中上调表达的基因有302个,下调表达的基因有239个。对差异表达基因的功能分析发现,下调表达的基因主要是参与海藻糖合成代谢、糖酵解、磷酸戊糖和几丁质合成途径的关键酶类,上调表达的基因中发现10个转运体,其中包括ADP/ATP carrier protein、机械敏感离子通道蛋白（Msc S）以及氨基酸转运体等能量物质转运蛋白。该结果表明孢原质自身的物质代谢能力显著下降,转为利用膜表面的转运体蛋白获取宿主的物质,揭示微孢子虫由休眠态转为寄生态。KEGG富集分析发现,孢原质与休眠孢子中蛋白的泛素化和磷酸化修饰系统的基因表达存在明显差异,进一步利用Western blotting验证发现孢原质中蛋白的泛素化水平升高,而磷酸化水平下降,表明蛋白的修饰作用在微孢子虫由休眠孢子转为孢原质过程中发挥着重要作用。3、家蚕微粒子虫孢原质与宿主细胞表面的互作分析对孢原质的细胞核和原生质膜进行活细胞染色,并添毒家蚕BmE细胞系,6 h后观察发现,孢原质可以黏附到宿主细胞表面,宿主细胞伸出凸起包裹孢原质,表明孢原质可能具有感染宿主细胞的能力,是一种感染态;18 h后,在宿主细胞内发现了被荧光标记的孢原质,表明孢原质具有感染力;48 h后,在宿主细胞中发现带有红色荧光标记的梨形孢子,表明孢原质不仅具有感染性,而且能够在宿主细胞内发育增殖。利用扫描电镜和透射电镜观察发现,孢原质与宿主细胞表面结合紧密,宿主细胞膜产生明显的内陷,并伸出一伪足包裹孢原质,推测孢原质是通过细胞吞噬进入宿主细胞的。进一步,利用生物素-链霉亲和素系统对介导孢原质与BmE细胞结合的表面蛋白进行了分离和质谱鉴定,获得了32个孢原质候选表面蛋白和188个家蚕细胞候选表面蛋白。对候选表面蛋白进行KEGG分析发现,家蚕细胞的膜运输通路可能介导了孢原质的侵入,这与我们的电镜结果相一致。对候选蛋白进行功能和亚细胞定位分析,筛选了6个孢原质蛋白和10个家蚕细胞蛋白作为候选互作分子。利用酵母双杂交实验进行互作验证发现,Nb1BD、Nb4BD和Nb6BD蛋白可能与Bm4AD和Bm6AD之间存在相互作用。其中Nb1BD、Nb4BD和Nb6BD都没有明确功能注释,Bm4AD为ABCC家族蛋白,Bm6AD为氨基酸转运体蛋白。4、家蚕微粒子虫孢原质的体外培养及遗传转化为基于孢原质建立微孢子虫的遗传操作体系,本文探索了孢原质的无细胞培养。参考微孢子虫代谢通路和孢原质转录组分析结果,以家蚕细胞系培养基为基础,配制了孢原质的培养液。培养观察发现,3天时孢原质的核分离移向两端,并出现多核孢原质,利用EdU和qPCR检测,发现孢原质细胞核中发生了DNA复制。对培养液成分检测发现,1-5天培养液中ATP的含量明显下降,而葡萄糖含量则没有明显变化,表明孢原质能够吸收利用ATP,而不能吸收葡萄糖。培养至第6天,孢原质未发生形态和数量的变化,但内部出现大量颗粒样结构,表明孢原质开始死亡,因此本研究配制的培养基可维持孢原质5天。继而,基于建立的孢原质体外维持体系,本研究构建了孢原质体外遗传操作方法。首先,以Nobo ABCG1.1基因为靶标,合成了该基因的干扰片段,对孢原质中该基因的表达进行RNAi。利用RT-qPCR和Western blotting检测发现,干扰后第3天Nobo ABCG1.1的表达量显著下降,表明孢原质可以用来开展基因的RNAi分析,从而建立了基于孢原质的微孢子虫RNAi方法。进一步,为建立孢原质的转基因操作方法,本文构建了分别以IE、A3、NB76、NB64和NB451为启动子的EGFP转基因载体,并转染孢原质。利用Western blotting检测EGFP的表达发现,在转染A3::EGFP的孢原质中检测到了EGFP的表达,表明孢原质可以进行转基因操作,从而建立了基于孢原质的微孢子虫转基因方法。综上,本研究实现了微孢子虫孢原质的分离纯化,获得了孢原质的形态、结构和基因表达方面的特征数据。证明了孢原质具有感染能力,获得了孢原质与家蚕细胞表面的互作蛋白,建立了孢原质的体外维持和感染方法。并初步构建了基于孢原质的微孢子虫遗传操作体系,为实现微孢子虫的细胞外培养和基因功能的原位分析提供了重要参考。