第一部分p120在机械通气肺损伤中的作用及机制实验一机械牵张对肺上皮细胞连接的影响及机制背景随着社会的老龄化,临床上各种原因导致的老年人呼吸功能衰竭以及感染、休克、复合伤等导致机体氧合障碍者,尤其是急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrom,ARDS)患者,呼吸机治疗已成为拯救生命的重要手段和措施。但多年来临床和实验均证实,在呼吸机治疗过程中常常会发生病情加重,氧合障碍及肺损伤加重,即呼吸相关性肺损伤或机械通气肺损伤(Ventilator-induced lung injury,VILI)的发生,使得接受呼吸机治疗患者住院天数延长、经济费用剧增且其发病率和死亡率居高不下,严重威胁患者的生命。因此研究和探索VILI的机制、避免或防治VILI发生对此类患者转归／提高生存率具有重要临床意义和社会价值。机械通气肺损伤,主要表现为肺水肿,肺毛细血管通透性增加,肺泡屏障受损,及继发的炎症因子释放,炎性细胞浸润。因此维持肺泡膜的完整性及肺血管通透性对防治机械通气肺损伤具有重要意义。反应肺泡膜和肺血管通透性最直接的指标是细胞连接,主要分为粘附连接和紧密连接。组成黏附连接的主要连接蛋白包括p120连环蛋白(p120-catenin, p120)、E-cadherin、α-catenin、β-catenin;组成紧密连接的主要连接蛋白包括occludin、ZO-1等。机械牵张可引起细胞连接破坏,细胞间隙增加,最终诱发肺水肿的形成,但机械牵张是如何破坏细胞连接导致肺水肿,其机制并未明确。因此,明确机械牵张对细胞连接蛋白的作用机制是防治机械通气肺损伤的关键问题。研究证明,外界刺激如炎症、低氧等可激活细胞内酪氨酸激酶(Tyrosine-protein kinase, c-Src)并引发一系列的炎症反应。c-Src是Src家族的成员,并参与细胞内信号的转导。有研究表明p120是c-Src激酶的底物,c-Src激活时可以引起p120降解。但c-Src在机械牵张诱发肺损伤过程中的机制并未明确,仍需进一步探讨。目的课题通过不同机械牵张模式牵张肺上皮细胞(mice lung epithelial cell, MLE-12),模拟临床机械通气肺损伤,探讨(1)机械牵张对肺上皮细胞连接蛋白表达及分布的影响(2)明确机械牵张过程中连接蛋白之间的结合状态及细胞间隙的形成。(3)通过使用c-Src激酶抑制剂,探讨机械牵张引起细胞连接破坏的机制。方法1.本研究采用FX-4000T Flexercell细胞牵张仪对单层生长小鼠肺上皮细胞株MLE-12进行牵张,20%周期牵张,0.5HZ,牵张2/4h。牵张刺激后检测以下指标：(1)免疫蛋白印记(western blot)检测机械牵张对粘附连接蛋白表达量的影响：p120、E-cadherin、occludin、α-catenin、β-catenin。(2)提取细胞膜及细胞浆蛋白,western blot检测E-cadherin胞膜及胞核分布。(3)免疫共沉淀(CO-Immunoprecipitation, CO-IP)检测机械牵张肺上皮细胞蛋白间连接变化：p120与E-cadherin, occludin与ZO-1。(4)免疫荧光共聚焦(Immunoflourescence)检测p120与E-cadherin结合程度及细胞间隙的形成。2.采用c-Src抑制剂PP2 (100nM溶于DMSO 30μl/ml)预处理MLE-12细胞30 min后,20%的牵张周期牵张2h。(1) western blot检测c-Src及p-c-Src的活性。(2) western blot检测p120、occludin表达量。结果1.机械牵张对连接蛋白及细胞连接的影响：(1)机械牵张对肺上皮细胞连接蛋白的影响。20%机械牵张刺激细胞2h、p120、E-cadherin、occludin、α-catenin表达较基础值降低,β-catenin表达升高。机械牵张4h后,p120、E-cadherin、occludin、α-catenin水平明显降低,β-catenin明显升高。结果显示除β-catenin外,其它连接蛋白的表达水平随着牵张时间的延长降解增加,与对照组比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。(2)机械牵张对E-cadherin分布的影响。机械牵张刺激肺上皮细胞2h、4h后,提取细胞膜及细胞浆蛋白,牵张2h导致细胞膜E-cadherin表达降低,而细胞浆表达增加,4h后与对照组比较,胞膜E-cadherin降低及胞浆增加明显,E-cadherin胞内吞差异具有显著意义(p<0.05)。(3)机械牵张对肺上皮细胞连接蛋白结合状态的影响：机械牵张肺上皮细胞2h后p120与E-cadherin、occudin与ZO-1结合均减少,牵张4h,蛋白与蛋白间的结合进一步降低。与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。免疫荧光共聚焦结果显示牵张2h,p120与E-cadherin结合减少,4h后进一步减少(p<0.05)。(4)机械牵张对肺上皮细胞间隙形成的影响：机械牵张2h后细胞间缝隙增加,牵张4h后细胞间大量缝隙形成,细胞连接破坏。与对照组比较有统计学意义(p<0.05)。2.机械牵张激活c-Src激酶,进一步引起p120、occludin降解。(1)机械牵张2h后c-Src活性增加,p-c-Src表达水平增加,但PP2预处理组激酶活性降低,与牵张组比较有统计学意义(p<0.05)。(2)机械牵张可引起p120、occludin细胞连接蛋白降解,PP2预处理组,细胞连接蛋白降解减少,与牵张组比较有统计学意义(p<0.05)。结论本研究证实：1.机械牵张可诱导肺上皮细胞连接蛋白及骨架蛋白的降解：p120、E-cadherin、occludin、α-catenin。2.机械牵张可引起肺上皮细胞E-cadherin胞浆转运,使E-adherin胞内吞增加。3.机械牵张可促进肺上皮细胞胞浆骨架蛋白的解离,导致肺上皮细胞连接缝隙增加。4.机械牵张肺上皮细胞可激活c-Src激酶,是引起细胞连接蛋白降解、细胞间隙形成的主要原因。5. c-Src抑制剂PP2抑制机械牵张引起的连接蛋白降解及细胞间隙的形成。以上结论表明,机械牵张可通过激活c-Src激酶,进一步引起肺上皮细胞间连接蛋白的降解及解离,从而使细胞间隙增加,肺泡膜通透性增加,是诱导肺水肿发生的主要因素。而c-Src激酶抑制剂PP2可抑制机械牵张引起的肺水肿,对机械牵张性肺损伤具有保护性作用。实验二 p120在机械通气肺损伤中的作用机制背景机械通气在临床是急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征患者必不可少的治疗方式。但在治疗的同时也能引起气道和肺泡损害,导致机械通气肺损伤。肺泡膜通透性增加最主要的原因是由于细胞连接蛋白的降解。机械牵张肺上皮细胞时,细胞底部由于牵张导致表面积增加,进而影响肺泡膜的完整性。以往研究表明：周期性牵张可引起肺上皮细胞结构和功能的改变,最终导致肺泡膜功能障碍及肺血管的高渗透性,导致肺水肿。尽管细胞连接蛋白的降解是VILI的主要诱因,但具体机制并未完全阐明。细胞连接蛋白主要由粘附连接和紧密连接构成。粘附连接蛋白主要包括p120、E-cadherin、α-catenin、β-catenin;紧密连接蛋白主要包括occludin、ZO-1等。研究证实,在肺血管内皮细胞,细胞连接蛋白可传导机械力牵张信号。我们前期研究发现：机械牵张肺上皮细胞可激活c-Src激酶,导致p120、occludin等细胞连接蛋白的降解。在脊椎动物p120一般分布在血管内皮细胞、肺上皮细胞、成纤维细胞等；已报道p120表达与肿瘤细胞的迁移、扩散等有关。最近研究证明人肺血管内皮细胞p120表达与炎症有关,p120减少可增加炎症易感性和严重性。p120为粘附连接蛋白,肺上皮细胞主要为紧密连接,然而occludin的表达量在机械牵张过程中也随着c-Src的激活而减少。因此,在机械牵张细胞间隙形成过程中,机械牵张引起的p120降解可能影响细胞内其它粘附连接蛋白及紧密连接蛋白的表达、分布,p120是通过何种机制影响细胞内其他连接蛋白仍需进一步探讨。因此,p120作为细胞内重要的细胞连接调节蛋白对机械通气肺水肿、肺损伤的发生发展具有重要意义。目的本课题通过离体肺上皮细胞周期性牵张和活体小鼠VILI模型,对以下问题进行研究：(1)明确p120对RhoA激酶活性的调节。(2)明确p120通过调节RhoA对细胞紧密连接的影响。(3)明确p120在机械通气肺水肿、肺损伤中的作用及机制。方法1.本研究采用c-Src抑制剂PP2及RhoA抑制剂Y27632预处理MLE-2,用FX-4000T Flexercell细胞牵张仪对转染的MLE-12进行牵张,20%周期牵张,0.5HZ,牵张2h。牵张刺激后检测以下指标：western blot、免疫荧光共聚焦检测E-cadherin、occludin表达量及细胞间隙的形成情况。2.采用p120 siRNA/p120 cDNA转染MLE-12细胞,再用细胞牵张仪对转染的MLE-12进行牵张,20%周期牵张,0.5HZ,牵张2h。牵张刺激后检测(1) GST pull down assay检测RhoA活性变化。(2)提取细胞膜及细胞浆蛋白,western blot检测E-cadherin胞膜及胞浆分布。(3)免疫共沉淀检测机械牵张肺上皮细胞内骨架蛋白间的连接变化：p120与E-cadherin, occludin与ZO-1。(4)免疫荧光共聚焦(Immunoflourescence)检测p120与E-cadherin结合程度及细胞间隙的形成。3.将预先配置好的p120 siRNA-liposome混合物注入C57BL/6小鼠眼底静脉丛,敲除小鼠体内大部分p120基因后进行机械通气,将小鼠分为正常对照组、高潮气量机械通气组、p120基因敲除组、p120基因敲除后高潮气量机械通气组(每一组n=5),或小鼠腹腔注射c-Src抑制剂PP2、RhoA抑制剂Y27632后进行高潮气量通气,检测以下指标：(1) western blot检测p120脂质体敲除效率。(2) GST pull down assay检测RhoA活性变化。(3) western blot检测肺组织E-cadherin、occludin的表达。(4)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测肺泡灌洗液IL-6, TNF-α的生成量。(5)取肺组织称量湿／干比值(Wet/Dry, W/D)。结果1.与机械牵张组比较,c-Src抑制剂PP2或RhoA抑制剂Y27632预处理组可以减少机械牵张引起的E-cadherin及occludin降解。2.(1)机械牵张可以激活RhoA, p120 siRNA处理组RhoA活性增加,机械牵张后,活性明显增加。(2)采用p120 siRNA转染MLE-12后进行牵张,p120 siRNA组E-cadherin降解,胞内吞增加,经牵张后胞内吞增加明显。与对照组比较,差异有统计学意义(p<0.05)；而p120cDNA转染组及转染后机械牵张组E-cadherin降解或胞内吞减少。(3) p120 siRNA组RhoA活性增加,occludin降解,occludin与ZO-1结合减少,机械牵张后降解增加,RhoA活性增加明显,occludin进一步降解,结合进一步降低；而p120过表达组机械牵张后RhoA活性降低,occludin降解减少,与ZO-1结合增加,p120与E-cadherin结合增加。(4)免疫荧光共聚焦结果显示与对照组比较,p120 siRNA组,p120与E-cadherin结合减少,细胞间隙增加；p120 cDNA组p120与E-cadherin结合增加,细胞间隙较机械牵张组明显减少。3.(1)经眼底静脉丛注射p120 siRNA的小鼠肺组织p120基因敲除70%。(2)经眼底静脉丛注射p120 siRNA的小鼠肺组织RhoA活性与对照组比较增加。(3)机械通气后小鼠肺组织E-cadherin、occludin表达降低,PP2及Y27632预处理组表达较机械通气组增高,且差异有统计学意义(p<0.05)。与对照组比较,p120基因敲除小鼠E-cadherin、occludin表达降低,机械通气后进一步降低(p<0.05)。(4)机械通气组小鼠肺组织W/D比率增加,PP2及Y27632预处理后,W/D比率较机械通气组降低,且差异有统计学意义(p<0.05)。而p120基因敲除小鼠W/D比率增加,机械通气后比值明显升高(p<0.05)。(5)机械通气组肺泡灌洗液中IL-6, TNF-α生成增加,但小鼠经PP2及Y27632预处理后,IL-6, TNF-α表达较机械通气组降低,且差异有统计学意义(p<0.05)。而p120基因敲除小鼠IL-6, TNF-α生成增加,机械通气后表达明显升高(p<0.05)。结论本研究得出：1. c-Src抑制剂PP2或RhoA抑制剂Y27632可以逆转机械牵张引起的细胞连接蛋白降解、细胞间隙增加。2.p120降解可以激活RhoA激酶活性。3. p120 siRNA转染后可加重E-cadherin内吞,occludin降解,促使occludin与ZO-1解离,细胞间隙增加。但p120过表达组E-cadherin内吞减少,occludin降解减少,occludin与ZO-1、p120与E-cadherin结合增加,细胞间隙修复。4.p120基因敲除小鼠肺组织细胞连接蛋白降解增加,多种炎症因子IL-6、TNF-α生成增加,肺组织湿／干比值增加,进一步加重VILI。5.高潮气量机械通气可以导致肺组织内细胞连接蛋白的降解,释放炎症因子IL-6、TNF-α,肺组织湿／干比值增加,诱发肺水肿。但c-Src抑制剂PP2或RhoA抑制剂Y27632可逆转机械通气引起的肺损伤。因此,本课题指出,机械通气激活c-Src后导致p120降解。p120降解一方面可诱导E-cadherin胞内吞,导致细胞粘附连接破坏,另一方面可激活RhoA激酶,进一步引起occludin降解,引起紧密连接功能破坏。p120是连接粘附连接与紧密连接的信号转导桥梁,是防治VILI的重要研究靶点。第二部分p120在感染性休克心肌损伤中的作用及机制背景感染性休克是医院患者死亡的主要原因之一,休克的发生率逐年增加,世界人口中每年大约18,000,000人口患有感染性休克疾病。休克早期死亡的主要原因归结于血氧分布失衡或心功能受损,进一步发展为严重炎性反应综合症,引起组织器官损伤,脏器衰竭。其中,心肺功能受损是感染性休克患者死亡的主要原因之一。感染性休克肺水肿、肺损伤的主要原因是由于细胞连接蛋白的破坏、炎症因子的释放导致肺血管内皮细胞通透性增加、内皮炎性破坏。我们前期研究已经证实细胞连接蛋白在感染性休克肺损伤中的重要性,但心脏细胞连接蛋白p120在感染性休克过程中对于机体重要脏器心脏功能的影响并未明确。心肌收缩障碍及循环障碍导致的心功能紊乱是感染性休克中死亡的主要原因,而感染性休克过程中的心肌收缩抑制机制复杂,并未完全阐明。心肌收缩主要与心肌闰盘相关,心肌闰盘则是由细胞桥粒、粘附连接、缝隙连接组成,在维持正常心肌收缩过程中都发挥着重要的作用。因此心肌细胞粘附连接结构破坏可直接引起心肌闰盘功能的缺陷,进而引起心肌收缩紊乱。心肌细胞粘附连接在心肌收缩过程中发挥着关键性作用。细胞粘附连接主要包括p120, N-cadherin and β-catenin。已有研究证明,p120的去磷酸化在内皮细胞中可导致细胞粘附连接的破坏,而人重组蛋白A5 (Annexin A5, Anx5)在心脏保护作用中可能与细胞膜的磷脂酰丝氨酸相结合调节p120的磷酸化与去磷酸化。本课题指出感染性休克中心肌收缩功能紊乱的主要原因之一是PKCa介导的p120的磷酸化与去磷酸化所引起的心肌细胞粘附连接功能破坏。而这一假设可通过心肌保护性药物Anx5及PKCa抑制剂被证实。p120在维持正常心肌收缩过程中发挥着重要的作用。目的本课题通过LPS处理离体心肌细胞及心肌细胞株H9c2明确p120在感染性休克过程中对心脏收缩功能的调节作用及机制。方法1.本研究采用LPS (1μg/ml)刺激小鼠心肌细胞0、2、4、6h,处理后检测以下指标：(1) western blot检测p120表达、PKCa活性；(2) CO-IP检测p120去磷酸化水平及与N-cadherin之间的关系。2.采用PKCa抑制剂G66976或PKCasiRNA转染H9c2细胞或心肌细胞,再用LPS (1μg/ml)处理细胞0、2、4h。处理后检测：(1) western blot检测p120表达、PKCa活性；(2) CO-IP检测p120去磷酸化水平及与N-cadherin之间的关系。(3)免疫荧光共聚焦检测心肌细胞间隙的形成。结果1.与对照组比较,LPS处理后心肌细胞p120表达降低,p120去磷酸化增加,PKCa被激活,p120与N-cadherin结合减少,且具有LPS处理的时间依赖性。2.H9c2细胞经PKCa抑制剂及PKCasiRNA处理后,LPS组较对照组比较p120去磷酸化增加,PKCa被激活,p120与N-cadherin结合减少,心肌细胞间隙增加。而PKCa抑制剂Go6976、PKCasiRNA或Anx5均可有效逆转LPS处理引起的一系列反应,差异有统计学意义(p<0.05)。结论本研究得出：1.LPS处理心肌细胞可引起p120去磷酸化增加,p120降解及与N-cadherin结合减少,心肌细胞连接受损。2. PKCa抑制剂Go6976、PKCasiRNA或Anx5均可抑制p120的去磷酸化及降解,同时逆转p120与N-cadherin的分离及心肌细胞间隙的形成。