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母猪泌乳性能较低是影响生猪产业发展的瓶颈因素。造成此现象的原因主要包括:泌乳期乳腺组织氧化应激增加,乳品质降低;母猪乳腺发育不良,泌乳量不足。利用营养手段降低乳腺组织氧化应激水平及促进乳腺发育对提高母猪泌乳性能具有重要生产意义。课题组前期研究表明,饲粮添加大豆异黄酮和植物提取物等抗氧化剂可不同程度的提高母猪泌乳量及改善乳质量,进而有效提高母猪泌乳性能。牛磺酸作为一种良好的抗氧化剂,母猪饲粮中添加是否可缓解乳腺氧化应激和促进乳腺发育,有效提高母猪泌乳性能目前未见报道。因此,本研究通过体外和体内试验,旨在探究饲粮添加牛磺酸对母猪泌乳性能的影响及分子机制。主要研究结果如下:试验一饲粮添加牛磺酸对初产母猪泌乳性能的影响本试验选取100头妊娠第90天的初产长白×大白二元杂(LY)母猪,将其随机分配至2个处理组:对照组(饲喂基础饲粮,不添加牛磺酸)和牛磺酸组(饲喂基础饲粮添加1%牛磺酸),每个处理组50头母猪,每头母猪作为1个重复。试验持续至泌乳第21天结束。结果表明:(1)添加牛磺酸对初产母猪总产仔数、仔猪初生重和初生窝重无显著影响(P>0.05),但显著提高泌乳期母猪采食量和仔猪断奶个体重、断奶窝重和平均日增重(P<0.05)。(2)添加牛磺酸显著提高初乳中乳蛋白含量(P<0.01),但对初乳及常乳中乳脂、乳糖、总固形物和非脂固形物含量无显著影响(P>0.05),表明添加牛磺酸改善初乳成分。(3)添加牛磺酸显著增加泌乳第1天和第10天血浆中IGF-1和催乳素含量(P<0.05),同时显著提高泌乳第1天和第10天乳中IGF-1的含量(P<0.05),但对血浆中胰岛素、葡萄糖、胆固醇、尿素氮、甘油三酯含量无影响(P>0.05)。(4)添加牛磺酸显著增加泌乳第1天和第10天血浆和乳中牛磺酸浓度(P<0.05),同时显著提高初乳中精氨酸、谷氨酸含量及常乳中蛋氨酸含量(P<0.05),表明牛磺酸影响母猪血浆和乳中氨基酸含量。(5)添加牛磺酸显著降低泌乳第10天血浆和乳中MDA含量,同时显著提高泌乳第10天血浆CAT活性及乳中T-SOD、T-AOC、GPx酶活性(P<0.05),表明牛磺酸缓解母猪氧化应激。因此,本试验结果表明妊娠后期和泌乳期饲粮添加1%牛磺酸提高仔猪断奶重,提高初产母猪泌乳性能。试验二饲粮添加牛磺酸提高初产母猪泌乳性能的机制研究仔猪断奶重的提高依赖母猪乳,乳腺发育决定乳产量和乳质量。本试验考察妊娠后期和泌乳期饲粮添加牛磺酸对初产母猪乳腺发育及氧化应激的影响,进一步阐述添加牛磺酸提高母猪泌乳性能的机制。选择16头妊娠75天初产LY母猪,随机分配到2个处理组:对照组(饲喂基础饲粮)和添加牛磺酸组(饲喂基础饲粮+1%牛磺酸),每个处理组8头母猪,每头母猪作为1个重复,试验持续至泌乳第21天结束。结果表明:(1)添加牛磺酸对初产母猪泌乳期体损失、背膘损失及仔猪初生重(P>0.05)无显著影响,但显著提高母猪泌乳期采食量、泌乳量和仔猪断奶重(P<0.05)。(2)添加牛磺酸显著增加泌乳第1天和泌乳第10天血浆和乳中IGF-1含量(P<0.05);同时显著提高泌乳第1天和泌乳第10天乳中乳蛋白含量(P<0.05)。(3)添加牛磺酸显著降低泌乳第1天和泌乳第10天母猪血浆和乳中MDA含量(P<0.05),同时显著提高泌乳第1天血浆及泌乳第1天和泌乳第10天乳中抗氧化相关酶(T-SOD、T-AOC、GPx)活性(P<0.05)。(4)添加牛磺酸显著降低泌乳第1天和泌乳第21天乳腺组织中MDA含量(P<0.05),提高T-AOC酶活性;同时显著增加泌乳第21天乳腺组织中Nrf2、NQO-1、Txnrd1等抗氧化蛋白表达量(P<0.05),表明牛磺酸缓解乳腺组织氧化应激。(5)添加牛磺酸显著增加泌乳第1天和泌乳第21天乳腺腺泡直径,提高乳腺组织DNA和蛋白含量(P<0.05),同时增加泌乳第21天乳腺组织中细胞增殖相关蛋白(Cyclin D1、STAT5)表达(P<0.05),表明牛磺酸促进乳腺发育。(6)添加牛磺酸显著增加泌乳第1天和泌乳第21天乳腺组织β酪蛋白的表达(P<0.05),同时上调m TOR信号通路相关蛋白(p-m TOR、p-S6)表达量。(7)添加牛磺酸显著增加哺乳第1天、第7天、第21天仔猪肠道抗氧化能力相关酶(T-SOD、T-AOC、GPx)活性(P<0.05),并显著降低仔猪肠道MDA含量(P<0.05);同时显著提高仔猪肠道绒毛高度和绒毛高度:隐窝深度比值,仔猪肠道紧密连接蛋白ZO-1表达显著上调(P<0.05),s Ig A分泌显著增加(P<0.05),表明牛磺酸促进仔猪肠道发育。因此,本试验结果表明牛磺酸通过促进乳腺发育和缓解乳腺组织氧化应激提高初产母猪泌乳性能。试验三牛磺酸缓解乳腺细胞氧化应激的机理研究试验二表明饲粮添加牛磺酸可有效缓解母猪乳腺组织氧化应激,改善乳品质,提高仔猪生长性能。因此,为进一步探究牛磺酸缓解乳腺氧化应激的机理,本研究利用猪乳腺上皮细胞(PMEC),通过H2O2建立氧化应激模型,采用不同浓度牛磺酸(0-2mM)并结合Nrf2 Si RNA干扰及MAPK抑制剂处理细胞,测定乳腺细胞ROS产生量和氧化应激相关蛋白表达量。结果表明:(1)与0μM H2O2组相比,500μM H2O2处理组显著降低细胞增殖率(P<0.05),同时显著降低T-SOD活性以及增加ROS产生量(P<0.05),表明氧化应激模型建立成功。(2)1.2 mM牛磺酸预处理后再进行H2O2处理,与仅使用H2O2单独处理组相比显著增加细胞数目(P<0.05)和T-SOD活性(P<0.05),降低ROS产生量(P<0.05);然而,当Nrf2基因被沉默后,ROS产生量显著增加(P<0.05),表明牛磺酸通过Nrf2信号通路抑制ROS产生。(3)1.2 mM牛磺酸预处理后再进行H2O2处理,与仅使用H2O2单独处理组相比显著增加Nrf2、x CT、NQO-1、HO-1的基因和蛋白的表达(P<0.05);然而,当Nrf2基因被沉默后,Nrf2、HO-1、NQO-1、Txnrd和x CT蛋白的表达量显著降低(P<0.05),表明牛磺酸通过Nrf2信号通路缓解PMEC氧化应激。(4)1.2 mM牛磺酸预处理后再进行H2O2处理,与仅使用H2O2单独处理组相比显著降低CHOP、GRP78基因和蛋白的表达(P<0.05);然而,当Nrf2基因被沉默后,CHOP、GRP78蛋白的表达量显著增加(P<0.05),表明牛磺酸通过Nrf2信号通路缓解PMEC内质网应激。(5)1.2 mM牛磺酸预处理后再进行H2O2处理,与H2O2单独处理组相比显著增加MAPK信号通路P38、ERK1/2、JNK1/2的磷酸化水平(P<0.05);与无抑制剂组相比,P38、ERK1/2、JNK1/2剂抑制添加后各处理组Nrf2蛋白表达显著降低(P<0.05),并显著降低HO-1、Txnrd1蛋白的表达(P<0.05),表明牛磺酸通过MAPK信号通路介导Nrf2发挥抗氧化功能。因此,本试验结果表明1.2 mM牛磺酸通过MAPK/Nrf2信号通路缓解PMEC氧化应激。试验四牛磺酸促进乳腺细胞增殖的机理研究本研究拟探究牛磺酸对乳腺细胞增殖的调控作用及机制。试验以PMEC为研究对象,利用不同浓度牛磺酸(0-2 mM)并结合m TOR特异性抑制雷帕霉素(Rap)处理细胞,旨在寻找牛磺酸调控乳腺上皮细胞增殖的关键信号通路。结果表明:(1)与对照组相比,1.2 mM牛磺酸组显著增加PMEC细胞增殖率(P<0.05)和G2+S期细胞数目(P<0.05),促使更多的细胞处于分裂期;Rap处理显著抑制细胞增殖,同时导致停滞于G1时期的细胞数目显著增加(P<0.05),表明牛磺酸通过m TOR信号通路调控PMEC增殖。(2)与对照组相比,1.2 mM牛磺酸组显著提高细胞增殖相关蛋白Cyclin D1基因和蛋白的表达量(P<0.05),同时,显著增加细胞内m TOR、S6和4EBP1蛋白磷酸化水平(P<0.05);Rap处理显著降低m TOR信号通路相关蛋白的磷酸化水平,同时降低Cyclin D1蛋白表达量(P<0.05)。(3)PMEC在正常生理状态或氧化应激模型状态下,使用1.2 mM牛磺酸处理均显著抑制细胞凋亡(P<0.05)。与对照组相比,1.2 mM牛磺酸组显著降低促细胞凋亡因子Bax基因和蛋白的表达(P<0.05),显著增加抑细胞凋亡因子Bcl2基因和蛋白的表达(P<0.05)。(4)与H2O2单独处理组相比,牛磺酸预处理后H2O2刺激组显著抑制细胞凋亡(P<0.05),然而,当Nrf2基因被沉默后,牛磺酸预处理对乳腺细胞的保护作用被废止(P<0.05),表现为下游的Bax表达量显著增加,Bcl2表达量显著降低(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),表明牛磺酸通过Nrf2信号通路抑制细胞凋亡。因此,本试验结果表明1.2 mM牛磺酸通过促进细胞增殖及抑制细胞凋亡调控乳腺发育。综上所述,母猪饲粮添加牛磺酸可有效缓解乳腺组织氧化应激并促进乳腺发育。牛磺酸可通过激活AMPK/Nrf2信号通路缓解乳腺组织氧化应激以及激活m TOR/Cyclin D1信号通路促进乳腺细胞增殖,提高母猪泌乳性能。