目的:非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是原发性肺癌的主要类型,严重威胁着人类生命安全和身体健康。对于不能选择手术治疗的患者,放射治疗和化疗是其主要的治疗方式。放化疗不仅能直接杀伤肿瘤,而且可以通过增强肿瘤的免疫原性以激活抗肿瘤免疫反应。但是放化疗也会促进肿瘤细胞PD-L1表达,诱导免疫逃逸,削弱治疗效果并最终导致治疗失败。因此本研究将通过药物筛选实验鉴定出介导放化疗诱导的NSCLC肿瘤细胞PD-L1表达升高的靶点,阐明其作用机制。方法:通过流式细胞术、Western Blot、RT-PCR、免疫荧光染色、免疫组化染色等方法检测NSCLC肿瘤细胞PD-L1变化。从两百多种药物中筛选出能够同时抑制放疗和顺铂治疗诱导的肿瘤细胞PD-L1表达增加的目标药物。使用si RNA沉默技术和BRD4抑制剂（JQ1和ARV771）探究BRD4蛋白在放化疗诱导肿瘤PD-L1表达中的作用。采用RNA-seq检测JQ1对NSCLC基因转录水平的影响。免疫共沉淀实验检测NSCLC肿瘤细胞中BRD4-IRF1相互作用,并探讨放疗、顺铂和JQ1处理对相互作用强度的影响。使用特异性的si RNAs沉默IRF1研究IRF1蛋白在放化疗诱导肿瘤PD-L1表达中的作用。CUT＆Tag实验检测BRD4-IRF1在PD-L1启动子区域的富集水平,并研究放疗、顺铂和JQ1处理对富集程度的影响。体外共培养实验探讨抑制BRD4逆转放化疗诱导的肿瘤PD-L1表达和anti-PD-1抗体对共培养体系中T细胞凋亡水平的影响。在C57BL/6小鼠Lewis移植瘤模型中验证JQ1联合放化疗和anti-PD-1抗体的抗肿瘤效果。移植瘤组织流式细胞分型和采用ELISA法检测肿瘤组织内IFN-γ和TNF-α以明确JQ1增强放化疗抗肿瘤免疫反应的机制。使用抗体清除CD8+T细胞以了解JQ1协同放化疗的抗肿瘤效应是否依赖于CD8+T细胞。动物实验中监测小鼠体重、小鼠主要脏器HE染色以及小鼠血中多种细胞因子检测以观察基于JQ1的联合治疗是否增加毒副反应。分析NSCLC肿瘤转录组数据和组织芯片染色数据探究BRD4/IRF1/PD-L1通路激活状态与T细胞功能和患者预后的关系。结果:首先,放疗和顺铂治疗均可以诱导NSCLC肿瘤细胞PD-L1表达升高,而且同步放化疗会进一步升高肿瘤PD-L1水平。本文首次通过药物筛选实验鉴定出BRD4抑制剂可以逆转放化疗诱导的NSCLC肿瘤细胞PD-L1表达。同时,JQ1也可以阻断IFN-γ诱导的NSCLC细胞PD-L1表达。其次,JQ1联合放化疗能够升高肿瘤细胞MHC-I分子的m RNA水平,增加肿瘤细胞免疫原性。Co-IP和CUT＆Tag实验显示,放疗和顺铂治疗能够促进BRD4招募IRF1至PD-L1启动子区域,激活PD-L1转录表达。JQ1可以逆转放化疗诱导的BRD4/IRF1在PD-L1启动子区域富集,阻碍治疗诱导的PD-L1转录表达,增强肿瘤浸润性CD8+T细胞的抗肿瘤活性,提高放化疗和anti-PD-1抗体治疗的疗效,而并不会增加治疗相关的毒性或者诱发细胞因子释放综合征。分析TCGA中NSCLC肿瘤的转录组数据表明,BRD4m RNA水平与PD-L1 m RNA水平呈正相关关系,而与MHC-I分子m RNA水平呈负相关关系。此外BRD4/IRF1/PD-L1通路的激活与耗竭T细胞水平呈正相关关系。NSCLC肿瘤组织芯片结果表明,BRD4蛋白水平与PD-L1阳性细胞比例呈正相关关系,而且BRD4和PD-L1高表达的NSCLC患者总生存时间较短。结论:以上结果表明放化疗激活BRD4/IRF1通路介导NSCLC肿瘤细胞PD-L1表达升高。首次发现并阐明BRD4抑制剂可以通过逆转放化疗诱导的NSCLC肿瘤细胞PD-L1表达,激活CD8+T细胞的抗肿瘤免疫反应,以进一步提高同步放化疗和anti-PD-1抗体治疗的疗效。靶向BRD4的治疗方案是增加NSCLC对放化疗和antiPD-1抗体治疗敏感性的一种安全且有效的新策略,具有良好的临床转化应用前景。