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贵金属纳米粒子作为一种新型的功能材料在近几十年来得到了充分的发展。贵金属纳米粒子普遍具有良好的生物相容性、可吸收性、无毒性和可蓄积性,在生物传感器方面有着广泛的应用前景。纳米金标记是目前生物标记的主要手段之一,而将其他的贵金属纳米粒子用于生物标记还鲜有报道。能否找到物理化学性质比纳米金更好的纳米粒子,使其能够代替纳米金成为生物标记的主力军,一直是我们实验室关注的重点。纳米Pd具有良好的催化活性(目前正广泛应用于催化领域),理论上可以让信号大大放大,使其成为生物检测的理想材料。本文的主要内容是在水溶液中制备颗粒大小均一、分散性好的纳米Pd粒子,通过化学方法将其表面功能化,并将寡核苷酸接到颗粒表面,制备出纳米钯标记的生物分子,并结合化学镀的优点,建立了新型的DNA检测技术。具体内容包括:
1.Pd纳米颗粒的制各、表面功能化及其与ssDNA的相互作用首先在水溶液中,我们采用共沉淀法,以乙醇为还原剂合成了不同稳定剂修饰的功能化Pd纳米颗粒,然后通过直接孵育藕联的方法制备纳米Pd标记的寡核苷酸生物探针。同时通过两步法合成羧基化的Pd纳米颗粒,并通过酰胺键的作用在颗粒表面修饰上寡核苷酸序列制备羧基化纳米Pd标记的寡核苷酸生物探针。多种分析结果证明寡核苷酸序列在羧基化纳米Pd颗粒表面固定牢固,当这种颗粒修饰上寡核苷酸序列后,在高浓度盐溶液中有较高的稳定性,DNA在纳米钯表面的覆盖率达到20pmol/cm2,适合用于核酸杂交等研究和实际应用。
2.“钯标铜染”检测DNA方法的研究在上述成功制备出纳米钯标记的寡核苷酸靶序列后,我们进一步提出了一种将化学镀与生物芯片相结合的“钯标铜染”微阵列核酸检测技术,这一点类似“金标银染”技术,即在修饰后的玻片表面固定已知序列的氨基化靶序列与纳米Pd标记的探针杂交反应后,利用Pd对Cu2+的催化还原反应,在Pd周围形成一层厚厚的Cu外壳。通过测定其灰度值来测定靶DNA存在与否。考察了铜镀液主盐浓度、还原剂浓度、络合剂、溶液pH以及杂交时间、探针浓度等对杂交结果的影响,研究结果表明镀液最佳条件是:A液:[CuSO4]=0.15M,[酒石酸钾钠]=0.4M,[NaOH]=1M;B液:[HCHO](37.2wt%),期中A:B(v/v)=25:2。结果表明这种方法特异性高,可明显区分DNA片段碱基的正错配,其灵敏度能达到2 nM左右,该方法不仅同样具有操作简单、快速等特点,更具有价格低廉,易于保存的优势,可以预期这一方法必将取代银染,成为生物检测的新进步。
3.基于生物素-链亲和素系统的纳米钯催化银增强检测DNA方法的研究基于生物素-链亲和素系统,研究了追加标记纳米钯催化银增强检测DNA的方法,通过掺入Biotin-11-dUTP对待测样品进行多重PCR扩增,将扩增的片段变性后与芯片上的探针进行杂交,加入链亲和素修饰的纳米钯,通过银染显示信号。相同条件下,纳米钯银染效果比纳米金更好,比较了这种检测方法的特异性并对灵敏度进行了测试。结果表明通过对转基因大豆两种基因进行检测,该方法具有良好的特异性,灵敏度可达0.1%。