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前言糖尿病是一种严重威胁人类身体健康的慢性代谢性疾病，其血管并发症已成为糖尿病患者致残和致死的主要原因。2型糖尿病是由长期高血糖、血脂异常、高血压、胰岛素抵抗组成的代谢综合征，长期高血糖和胰岛素抵抗可直接或间接损害内皮细胞功能，细胞因子的合成及活性改变，导致血栓形成。目前，血管并发症的发病机理至今尚未完全阐明，大多数学者认为可能与血管内皮细胞损伤、血小板激活、凝血和纤维蛋白溶解系统异常等因素有关，其中血管内皮细胞损伤是糖尿病慢性血管并发症的重要启动因子和关键因素。血管内皮细胞覆盖整个循环系统内表面，作为一个重要的自分泌和旁分泌组织，合成及分泌一系列抗凝和促凝因子，直接或间接的影响止凝血系统的平衡，是血栓形成中重要的调节物质。大量研究表明，血管内皮细胞蛋白C受体（EPCR）和血栓调节蛋白（TM）是体内蛋白C抗凝血系统的重要组成成份，均由血管内皮分泌产生，当各种因素导致内皮细胞受损，血浆中EPCR和TM浓度明显升高，成为反映内皮细胞损伤的敏感指标，它们可作为血管内皮损伤的分子标记物。因此，本课题设计对体外培养的人脐静脉内皮细胞施以不同浓度的葡萄糖和胰岛素处理后，检测上清液中可溶性内皮细胞蛋白C受体（sEPCR）和可溶性血栓调节蛋白（sTM）水平，分析抗凝系统与内皮细胞功能损伤和血管病变的相关关系，为深入研究糖尿病血管病变的发生机理和干预治疗提供理论基础和临床经验。实验材料与方法一、实验材料1、实验细胞人脐静脉内皮细胞ECV304细胞株2、主要试剂及药品DMEM／F-12培养基、葡萄糖、胰岛素、0.25％胰蛋白酶、0.02％EDTA、10％胎牛血清、EPCR和TM检测试剂盒3、主要仪器超净工作台、CO2孵箱、低温离心机、培养板、超低温冰箱、倒置显微镜、全自动酶标仪、电子天平、细胞培养板、微孔滤器二、实验方法1、细胞培养细胞复苏后，加入2ml 0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA联合消化液2～3分钟后弃掉消化液，加入含10％胎牛血清的DMEM／F-12培养基终止消化，轻轻吹打混匀细胞，按1：2传代于培养板中。37℃，5％CO2孵箱中培养，每2～3天换液一次，3～4天传代一次，传至3～4代后选取80％融合生长良好的细胞进行实验。2、实验分组调整内皮细胞细胞数在105／ml，接种于12孔培养板中，然后随机分为实验组和对照组。根据葡萄糖和胰岛素的不同浓度将实验组分为下列9组：1组：葡萄糖浓度5.5mmol／L；2组：葡萄糖浓度20mmol／L；3组：葡萄糖浓度40mmol／L；4组：胰岛素浓度0.1nmol／L；5组：胰岛素浓度1nmol／L；6组：胰岛素浓度10nmol／L；7组：葡萄糖浓度40mmol／L+胰岛素浓度0.1nmol／L；8组：葡萄糖浓度40mmol／L+胰岛素浓度1nmol；9组：葡萄糖浓度40mmol／L+胰岛素浓度10nmol。对照组：葡萄糖浓度0mmol／L，胰岛素浓度0nmol／L。每组3个标本，分别于0h，6h，24，48h，72h等不同培养时间，收集上清液进行检测。3、ELISA法检测sEPCR及sTM根据预实验结果，sEPCR经2倍稀释，sTM用细胞培养原液，采用ELISA双抗体夹心法检测，具体操作按说明书。4、数据统计采用SAS统计软件及重复测量资料的方差分析进行统计学处理。实验数据以（?）±S表示，组间比较用多个样本均数两两比较的SNK法。P＜0.05有显著差异。实验结果一、葡萄糖对脐静脉内皮细胞分泌sEPCR的影响细胞培养液中加入不同浓度葡萄糖后，同一浓度葡萄糖组随着培养时间的延长，内皮细胞分泌sEPCR的水平逐渐升高且均高于对照组（p＜0.01）；不同浓度葡萄糖组培养24h以前，随葡萄糖浓度的增大，内皮细胞分泌sEPCR的水平逐渐升高（p＜0.01），但培养48h后，3组与2组相比，内皮细胞分泌sEPCR的水平不再升高，反而下降。二、胰岛素对脐静脉内皮细胞分泌sEPcR的影响同一浓度胰岛素组在培养6h时，内皮细胞分泌sEPCR的水平较对照组降低，但无统计学意义；培养24h后，同一浓度胰岛素组随着培养时间的延长，内皮细胞分泌sEPCR的水平逐渐升高且均高于对照组；不同浓度胰岛素组培养48h前，随胰岛素浓度的增大，内皮细胞分泌sEPCR的水平逐渐升高，但培养72h时，6组与5组相比，内皮细胞分泌sEPCR的水平不再升高，反而下降。三、胰岛素对高糖环境下（葡萄糖浓度40mmol／L）脐静脉内皮细胞分泌sEPCR的影响在高糖环境培养液中，不同浓度胰岛素组培养24h内，sEPCR的水平与实验3组（单独应用高浓度葡萄糖）相比均降低；培养48h后，9组、8组与3组相比sEPCR的水平又显著升高，但培养72h时，9组与8组相比，内皮细胞分泌sEPCR的水平不再升高，反而下降。四、葡萄糖和胰岛素对脐静脉内皮细胞分泌sTM的影响葡萄糖和胰岛素的浓度及作用时间对内皮细胞分泌的sTM的水平与对照组没有显著差别。结论1、一定浓度葡萄糖可以增加脐静脉内皮细胞分泌sEPCR的水平，但高浓度的葡萄糖随着作用时间的延长，sEPCR的分泌水平不再增加。2、胰岛素在一定程度内可以降低高浓度葡萄糖组内皮细胞分泌sEPCR的水平，提示胰岛素可以抵消高浓度葡萄糖对内皮细胞的损伤作用，但高浓度的胰岛素和高血糖可以加重内皮细胞的损伤。3、葡萄糖和胰岛素单独与联合应用对脐静脉内皮细胞sTM的分泌没有影响。