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“衣、食、住、行”是关系每个人生活水平的四件事,其中“衣”为首位,其重要性可见一斑。棉纤维制品良好的吸湿性及透气性使其深受人们喜爱,而棉花作为一种重要的经济作物,经常受到病虫害、干旱、极端天气等多种生物胁迫与非生物胁迫的影响,导致棉花产量和品质大幅降低。因此,研究棉花胁迫应答的分子机制,通过转基因技术增强棉花抗性,有利于棉花产量的提高与品质的改善。脱落酸(ABA)是植物体内一种与环境胁迫相关的重要信息调控物质。近年来,在拟南芥中的研究揭示了一条比较完整的ABA信号通路,但有关棉花中ABA的作用机制目前还没有相关的报道。本实验室分离鉴定了一个PP2C(Protein phosphatase 2C)家族的基因GhDRPP1,可能在ABA信号通路及棉花干旱胁迫应答中发挥重要作用。本文主要对GhDRPP1转基因棉花后代株系进行相关的表型遗传分析及其抗旱性等方面的探究。1、GhDRPP1转基因棉花的抗旱性及相关生理生化指标分析本文对T3代和T4代GhDRPP1过量表达(OE)与RNAi转基因棉花进行了遗传及生化分析。干旱处理和生理指标的测定结果表明,与野生型棉花(WT)相比较,GhDRPP1过量表达转基因棉花株系具有明显不耐旱的表型,而RNAi株系则更为抗旱,且该表型是可以稳定遗传的。GhDRPP1过量表达转基因棉花株系在干旱胁迫下,叶片内的H202含量、MDA含量显著高于野生型,反映了其在干旱条件下因失水而受到的损伤更为严重;相反,植物体内清除活性氧的酶SOD和POD活力比较低,反映了其在应对干旱胁迫时较弱的适应性。而GhDRPP1 RNAi株系叶片内H202和MDA含量低于野生型,SOD和POD酶活性高于野生型。此外,为了更全面地了解GhDRPP1过表达或部分沉默后对棉花植物体产生的影响,对GhDRPP1过量表达与RNAi转基因棉花及野生型棉花种子大小进行比较,纤维长度进行了测量,发现转基因棉花与野生型相比,在种子大小和棉纤维长度上没有明显差异,这表明该基因过量表达或抑制表达不影响棉花种子和纤维品质等农艺性状。2、GhDRPP1与互作蛋白之间的相互作用分析本实验室在先前的研究中,以GhDRPP1为诱饵蛋白,筛选干旱胁迫条件下棉花叶片cDNA文库,筛选到一些候选的互作蛋白。为了寻找可能与GhDRPP1相互作用的蛋白,本文分离克隆了其中5个候选基因GhD03G1306、GhA11G0835、GhA08G1057、Gh_A07G0741、Gh_A12G2092的cDNA全长序列,分别构建到pGADT7载体上,与pGBKT7-GhDRPP1进行酵母双杂交实验分析。结果显示,Gh_D03G1306和Gh_A08G1057可以与GhDRPP1发生相互作用,但其他三个蛋白不能与GhDRPP1相互作用。GO聚类分析结果显示,Gh_D03G1306(KINB3)编码SNF1 相关蛋白激酶的调节亚基 3(SNF1-related protein kinase regulatory subunit beta-3),可能参与细胞代谢中蔗糖应答、调控氮含量等,分子功能上与蛋白结合有关;Gh_A08G1057可能参与染色质重组、DNA配对等。3.干旱条件下的GhDRPP1转基因棉花叶片转录组分析及验证为了探究GAhDRPP1参与干旱胁迫的分子机理,我们对GhDRPP1过量表达(OE)、RNAi及野生型棉花进行正常条件和干旱5天后的叶片转录组进行比较分析。结果显示,对比正常条件下的WT、OE、RNAi株系,干旱5天之后三个株系的差异表达基因分别为:6805个、6164个、2417个,可见干旱条件下,植物体通过一个广泛、复杂的调控网络来应答干旱胁迫。在正常条件下,GhDRPP1 OE转基因株系与野生型相比有11个差异表达基因;GhDRPP1 RNAi转基因株系与野生型相比有9个差异表达基因。干旱5天后,在GhDRPPP OE转基因棉花株系出现差异表达基因1932个,其中1072个上调,860个下调;GhDRPP1 RNAi转基因株系与野生型相比有605个差异表达基因,其中389个上调,216个下调。在干旱条件下,无论是GhDRPP1 OE还是RNAi转基因株系,与野生型相比都出现大量的差异表达基因,这暗示着GhDRPP1在干旱胁迫应答中发挥重要功能。将这些差异表达基因进行注释后,与GhDRPP1进行共表达分析,对部分与GhDRPP1相关性较高的基因进行了 qRT-PCR分析验证,找到一些可能受到GhDRPP1调控的蛋白,如脯氨酸转运因子(ProT1)、半胱氨酸的类受体激酶 25(RLK25)等。根据GO聚类分析以及KEGG分析,推测GhDRPP1主要通过影响脱落酸和赤霉素信号转导途径,不利于气孔关闭等一系列胁迫应答反应,并且影响整个激素信号调控网络,导致过量表达转基因棉花株系对干旱敏感。与野生型相比,RNAi株系光合作用增强可能是其抗旱性增强的原因之一。挑选部分差异表达基因,进行qRT-PCR分析验证,结果表明上述转录组数据基本真实可靠。将可能参与ABA信号通路的基因、受胁迫调控的marker基因、组成光系统的一些基因在不同株系中的表达量制成热图并进行了分析。根据以上分析,我们认为GhDRPP1蛋白可能通过参与脱落酸及赤霉素信号通路等多种激素信号转导途径,影响气孔关闭、光合作用等,从而在棉花干旱胁迫应答中起负调控作用。