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【研究背景】骨骼是动态变化的器官,不断经历着骨重塑的自我再生过程,在此过程中破骨细胞调控的旧骨吸收和成骨细胞调控的新骨形成之间维持动态平衡。在失重环境中,由于承重骨所受重力负荷减少,这种平衡状态被打破,表现为骨吸收增加和骨形成减少,导致骨丢失现象的发生。在长期在轨飞行中,航天员的骨密度每月下降约1~1.5%,且返回地面后较长时间难以恢复至正常水平,严重威胁航天员的身体健康,成为制约长期太空飞行的重要医学难题。尽管采取了体育锻炼、营养补充和药物预防等措施来保护航天员的肌肉骨骼系统,但承重骨的骨丢失现象并未得到显著改善。因此,深入探究失重性骨丢失的分子生物学机制,寻找关键性防治靶点十分重要。表观遗传学在调控骨稳态过程中发挥了重要作用,常见的表观遗传学修饰包含非编码RNA、DNA甲基化以及组蛋白修饰等。目前对失重性骨丢失的表观遗传学研究主要集中于非编码RNA,DNA甲基化在失重性骨丢失中的作用则鲜有报道。DNA甲基化修饰可抑制基因的表达,常见的抑制方式包括启动子区DNA序列的甲基化直接干扰转录因子与之特异性结合;DNA甲基化可改变染色质的空间结构,间接抑制转录因子的结合;DNA甲基化的“阅读器”——甲基化Cp G结合蛋白（MBD）招募其他蛋白形成复合物并结合于启动子区甲基化序列,进而抑制基因转录。其中MBD1可招募ATF7ip并结合于甲基化的Cp G序列参与神经系统发育、免疫系统疾病以及癌症等过程的抑制性调控,但MBD1和ATF7ip参与骨骼系统功能调控的相关研究却鲜有报道。【目的】本研究为揭示DNA甲基化修饰在失重性骨丢失中的调控作用及其机制,以ATF7ip-MBD1复合物为切入点,探索模拟失重条件下ATF7ip和MBD1的表达变化,以及其对成骨细胞分化及骨形成的调控作用和机制,并以ATF7ip-MBD1复合物为干预靶向,探究其对失重性骨丢失的防护效果。【方法】1.为研究ATF7ip和MBD1在模拟失重条件下成骨细胞中的变化,采用2D回转器对体外MC3T3-E1细胞进行模拟失重处理48 h,采用HLU小鼠构建失重性骨丢失模型,并通过Micro-CT检测小鼠后肢骨量以评估失重效果。通过q RT-PCR和western blotting检测ATF7ip和MBD1在模拟失重条件下的差异性表达。2.为证实ATF7ip和MBD1在成骨细胞中的作用关系,采用IF检测ATF7ip和MBD1在MC3T3-E1细胞中的定位,采用Co-IP检测ATF7ip和MBD1在成骨细胞中是否结合为复合物。3.为评估ATF7ip和MBD1对成骨细胞分化和矿化的影响,使用si RNA敲减ATF7ip或MBD1的表达,使用质粒补充ATF7ip的表达,并采用q RT-PCR和western blotting检测RUNX2、COL1A1、ALP和OCN等成骨分化标志物的表达水平,ALP染色检测成骨细胞中ALP酶活性,茜素红染色检测矿化结节数目。4.为探讨ATF7ip和MBD1在模拟失重条件下对成骨细胞分化的作用,在MC3T3-E1细胞回转模拟失重处理前转染过表达ATF7ip和MBD1的质粒,并检测成骨细胞分化标志物的表达。5.为探索ATF7ip和MBD1在骨形成和骨丢失防护中的作用,使用Cre-Loxp系统构建Atf7ip或Mbd1在成骨细胞中条件性敲除的小鼠模型,采用（DSS）6-liposome骨靶向递送系统在基因敲除小鼠或HLU小鼠的骨形成区靶向补充ATF7ip或MBD1,通过Micro-CT、Goldner三色法染色、钙黄绿素双标试验和三点弯曲试验检测小鼠的骨微结构、骨密度、新骨形成速率和生物力学性能。6.为寻找ATF7ip和MBD1下游靶基因,采用基因测序技术筛选转染si-Mbd1后的上调基因,通过焦磷酸测序检测候选基因Grem2启动子区甲基化水平,Ch IP检测MBD1与Grem2启动子区的结合情况,双荧光素酶报告基因实验验证ATF7ip和MBD1对Grem2启动子区活性的影响。7.为检测GREM2对成骨细胞分化及矿化功能的影响,在MC3T3-E1细胞中转染pc DNA3.1-Grem2质粒或si RNA改变GREM2的表达,通过q RT-PCR和western blotting检测成骨分化相关因子ALP、COL1A1、RUNX2和OCN的表达水平,ALP染色检测成骨细胞中ALP酶活性,茜素红染色检测矿化结节数目。8.为探索模拟失重条件下ATF7ip-MBD1复合物是否通过GREM2促进成骨细胞分化,在MC3T3-E1细胞模拟失重前转染Atf7ip、Mbd1和Grem2的过表达质粒,并通过q RT-PCR和western blotting检测RUNX2、COL1A1、ALP和OCN等成骨分化标志物的表达水平。【结果】1.ATF7ip和MBD1在2D回转模拟失重的成骨细胞和HLU小鼠后肢骨中均表达降低。2.ATF7ip和MBD1在MC3T3-E1细胞中均定位于细胞核且可形成蛋白复合物。3.ATF7ip和MBD1均可促进成骨细胞的分化及矿化,且ATF7ip对成骨细胞功能的调控依赖于MBD1。敲低ATF7ip或MBD1可抑制成骨细胞的分化和矿化;在MBD1正常表达的细胞中过表达ATF7ip可促进成骨细胞的分化及矿化,而在MBD1低表达的成骨细胞中过表达ATF7ip对成骨细胞分化及矿化功能无显著影响。4.模拟失重条件下ATF7ip对成骨细胞分化功能的作用依赖于MBD1,并可增强MBD1对成骨细胞分化的促进作用。单独过表达ATF7ip对模拟失重所致的成骨细胞分化功能障碍无明显作用,但同时过表达ATF7ip和MBD1可缓解模拟失重条件下的成骨细胞分化受抑制现象,且这一作用优于单独过表达MBD1组。5.ATF7ip和MBD1均可促进基因敲除小鼠骨形成,且ATF7ip对骨形成的作用依赖于MBD1。Atf7ipf/f Osx-Cre小鼠和Mbd1f/f Osx-Cre小鼠的骨微结构、骨密度、新骨形成速率和生物力学性能均减弱。骨靶向递送ATF7ip于Atf7ipf/f Osx-Cre小鼠的成骨区可显著缓解骨丢失现象,但骨靶向递送ATF7ip于Mbd1f/f Osx-Cre小鼠成骨区后无明显作用,同时靶向递送ATF7ip和MBD1可缓解Mbd1f/f Osx-Cre小鼠的骨丢失,且效果优于单独靶向递送MBD1组。骨靶向递送ATF7ip和MBD1可缓解失重性骨丢失的发生。6.Grem2是MBD1的靶基因。当ATF7ip或MBD1敲低时,GREM2表达升高。MBD1可结合于Grem2启动子区甲基化的Cp G序列,并抑制其启动子区活性。7.GREM2可通过调控SMAD1/5/8磷酸化水平抑制成骨细胞的分化及矿化功能。转染si-Grem2可促进成骨细胞的分化及矿化功能,过表达GREM2可抑制成骨细胞的分化及矿化功能。8.模拟失重条件下过表达GREM2可减弱ATF7ip-MBD1蛋白复合物对成骨细胞分化的促进作用。【结论】1.ATF7ip和MBD1在成骨细胞中形成蛋白复合物,且在模拟失重条件下均表达下调。2.ATF7ip-MBD1复合物可促进成骨细胞的分化及矿化功能,并可缓解失重条件下成骨细胞分化障碍。ATF7ip对成骨细胞功能的调控依赖于MBD1,并增强MBD1的作用。3.ATF7ip-MBD1复合物可促进小鼠骨形成,并可抑制失重性骨丢失的发生。ATF7ip依赖并增强MBD1对骨形成的促进作用。4.ATF7ip-MBD1复合物通过结合于Grem2启动子区甲基化的DNA序列并抑制其表达进而调控成骨细胞的分化功能。综上所述,本研究发现ATF7ip和MBD1在模拟失重条件下表达降低,ATF7ipMBD1复合物可通过DNA甲基化修饰促进成骨细胞分化与骨形成,并缓解失重性骨丢失的发生,该工作成果为失重性骨丢失的防护提供了新的干预靶点和理论依据。