甘草酸、柚皮苷单克隆抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立

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研究目的:制备两种重要的中药活性成分 ——甘草酸和柚皮苷的单克隆抗体,基于这两种单克隆抗体建立免疫分析方法,并对其进行方法学考察。为含有甘草酸和柚皮苷的药物及复方的质量控制、体内过程等研究提供一种新的技术手段。研究方法:采用改进的高碘酸钠氧化法,制备人工免疫原GA-BSA、NAR-BSA和人工包被原GA-OVA、NAR-OVA,用紫外分光光度法对以上合成的产物进行鉴定。用合成的人工免疫原分别免疫BALB/C小鼠,每只100μg与等体积弗氏佐剂乳化均匀后背部皮下多点和腹腔注射,每隔两周加强免疫一次,以充分诱导小鼠的免疫应答。三次免疫后尾尖取血,间接ELISA检测抗血清的效价,评价免疫效果;间接竞争ELISA检测抗血清的特异性。取免疫后小鼠的脾脏制备脾单细胞悬液,PEG法与SP2/0细胞融合,筛选分泌所需抗体的杂交瘤细胞,有限稀释法单克隆化获得单克隆细胞株,采用体内腹水诱生法大量生产抗体。基于单克隆抗体建立间接竞争ELISA方法,考察该方法的特异性、灵敏度、交叉反应率、回收率等相关指标,并将其用于药材、复方和生物样品的测定。结果:(1)采用改进的高碘酸钠氧化法,制备人工免疫抗原GA-BSA、NAR-BSA和人工包被抗原GA-OVA、NAR-OVA,经紫外分光光度法鉴定,以上合成的产物均偶联成功,偶联比在14.2:1-23.9:1之间。(2)使用GA-BSA免疫Balb/C小鼠,以GA-OVA作为包被抗原,间接ELISA法对免疫五次后的小鼠血清效价和特异性进行检测,结果显示免疫小鼠血清效价均在1:12800以上,且可作出竞争抑制曲线显示对甘草酸具有特异性。使用NAR-BSA免疫Balb/C小鼠,以NAR-OVA作为包被抗原,间接ELISA法对免疫五次后的小鼠血清效价和特异性进行检测,结果显示免疫小鼠血清效价均在1:6400以上,且可作出竞争抑制曲线显示对柚皮苷特异性。(3)取GA-BSA免疫的小鼠脾细胞进行细胞融合,单克隆化,最终获得稳定分泌抗甘草酸抗体的杂交瘤细胞株,命名为GA-Mab-DF5并采用腹水法大量生产单抗。取NAR-BSA免疫的小鼠脾细胞进行细胞融合,单克隆化,最终获得稳定分泌抗甘草酸抗体的杂交瘤细胞株,命名为NAR-Mab-AB6并采用腹水法大量制备腹水单抗。(4)应用制备的腹水单抗GA-Mab-DF5,建立间接竞争ELISA法,并对其反应条件进行了优化。在甘草酸1-256μg/ml范围内,包被原GA-OVA1:2000稀释,纯化腹水1:10000稀释下,得到GA-Mab-DF5的抑制率与线性关系曲线,计算显示线性范围为4-64μg/ml,回归方程为y=-0.31n(x)+1.3594,R2=0.9986.灵敏度以IC50计,求出甘草酸标准溶液浓度为17.14μg/ml,最低检测限以IC10计,计算出对应甘草酸标准溶液浓度应为4.59μg/ml。应用制备的腹水单抗NAR-Mab-AB6,建立间接竞争ELISA法,并对其反应条件进行了优化。在柚皮苷1-450ng/ml范围内,包被原NAR-OVA1:2000稀释,腹水1:4000稀释条件下,]MAR-Mab-AB6的抑制率与线性关系曲线,线性范围为14-225ng/ml回归方程为y=-0.4111n(x)+2.5018,R2=0.998.灵敏度以IC50计,求出对应的柚皮苷标准溶液浓度为84.45ng/ml,最低检测限以IC10计,计算出对应柚皮苷标准溶液浓度应为19.70ng/ml。(5)通过间接竞争ELISA(?)检测单抗与甘草酸及其它中药活性成分反应的交叉反应率。结果显示与甘草次酸交叉反应率为31.55%,与其他成分的交叉反应率均小于0.09%。表明本研究得到的抗甘草酸单抗对甘草酸有很好的特异性。通过问接竞争ELISA法检测单抗与柚皮苷及其它中药活性成分反应的交叉反应率。结果显示在二十余种化合物和四十余种中药粗提物中与除葛根素、芦丁、大黄酸、葛根提取物、大戟提取物有较强交叉反应外,其余均无交叉反应。表明本研究得到的抗柚皮苷单抗对柚皮苷有较好的特异性。
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